背景和目的:纳米材料的大量生产和广泛应用带来新的环境污染和职业暴露问题。它们现在被广泛应用于化妆品、食品包装、药物治疗、生物传感器等领域,导致人体广泛暴露于富含纳米材料的环境中,可能会对人体产生潜在的毒性影响^[1-3]。近十年来,纳米材料对肺、皮肤、肝脏、肾脏、脾脏等主要器官的毒性研究越来越多^[4-6],而眼睛属于体表器官,在评价纳米材料的毒性研究中,往往被忽略。与其他内在的器官相比,眼睛直接与纳米材料接触可能会造成更大的机体损害。尽管通过眨眼和泪膜可将大尺寸颗粒阻挡在眼表外,但小尺寸纳米颗粒与眼表接触后,长时间附着在角膜上,可穿越眼表屏障到达眼后段。持续暴露于环境污染物（如灰尘、柴油废气颗粒、纳米材料等）中,可能对眼睛造成不良影响^[7-8],诱发严重的眼部疾病甚至失明^[9-10]。因此,纳米材料对眼的安全性评价引起了广泛关注,但目前尚处于研究的初步阶段。到目前为止,关于纳米粒子（Nanoparticles,NPs）对眼的毒性研究主要集中在NPs的类型、大小、表面电荷、氧化状态和暴露时间^[11-13]。而NPs另一个重要的特征—表面积改变对眼的毒性效应尚未见报道。众所周知,NPs与生物系统的相互作用在其毒理效应中发挥关键作用^[14-16]。大的表面积可提供更多的表面暴露原子^[17],使得NPs更容易与周围更多的化学或生物分子结合,从而增强其表面反应活性和毒性作用^[18]。研究表明,增加NPs的表面积被认为是启动机体炎症反应的有效途径^[19]。此外,据报道多孔的NPs比无孔NPs因具有更大表面积而产生更强的生物毒性,如多孔NPs—蛋白相互作用更容易引起血管系统的损伤^[20]。我们推测,具有较大表面积的纳米材料可能同样会对眼产生更严重的毒性作用,表面积作为NPs的重要表征,在衡量NPs生物毒性时需要被考虑在内。近年来,二氧化硅纳米颗粒（Silica nanoparticles,SiNPs）由于具有易于调节的尺寸和形态,被大量生产并广泛应用,是世界上产量最高的纳米材料之一^[21]。SiNPs有两种形式:非介孔SiNPs（Non-mesoporous SiNPs,NSiNPs）和介孔SiNPs（Mesoporous silica nanoparticles,MSiNPs）。MSiNPs一定的孔隙率使其比NSi NPs具有更大的表面积,这将极大地提高其吸附能力,使其能够作为功能性载体用于药物的运输,如眼内给药^[22-23]、口服给药^[24]、抗癌药物输送^[25]。然而,大表面积的MSiNPs也可能具有更强的毒性作用,这是因为大表面积导致反应活性高,吸收能力强。研究发现,MSiNPs具有细胞毒性,包括诱导氧化应激和DNA损伤、抑制细胞增殖以及诱导细胞凋亡^[26-27]。除此之外,研究报道MSiNPs通过静脉注射进入人体时会造成肝损伤^[28]。眼部药物递送是当前研究中的前沿领域。SiNPs是用于眼科药物递送的有前途的药物载体。已知与血管生成有关的角膜盲症包括由病理性血管生成引起的角膜疾病,导致视力损害。研究发现MSiNPs可以抑制化学性烧伤引起的角膜新生血管的形成^[22]。另一项研究表明MSiNPs用于前房内青光眼的药物输送治疗^[23]。这使角膜频繁与MSiNPs接触,而其对角膜产生的毒性作用尚未见报道。本研究将探讨NPs的重要表征大表面积对眼角膜的安全性的影响,研究MSiNPs对眼角膜的毒性作用。此外,由于MSiNPs很容易吸附其他有毒物质,进而产生额外的有害影响和产生协同毒性^[29-30]。银产品在日常生活和医疗卫生中被广泛使用^[31-33],银产品可连续释放银离子,Ag+表现出较高的细胞毒性,可导致细胞活力显著降低、DNA损伤和遗传毒性^[34-37]。Ag⁺暴露在空气中通常与包括NPs在内的多种污染物共存^[38-39],被MSiNPs吸附可能会大大增强Ag⁺被细胞摄取和在细胞内的积累,引起更严重的细胞毒性。本研究选择银离子作为MSiNPs吸附的有害物质进行眼角膜毒性研究。材料与方法:第一部分NSiNPs、MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺的制备及表征·通过扫描电子显微镜（S-4800,Hitachi,Japan）和透射电子显微镜（TEM,JEM2100 Plus）分别对FITC-NSiNPs和FITC-MSi NPs的粒径形貌和大小进行表征。·采用动态光散射法（DLS,Omni）测定FITC-NSiNPs和FITC-MSiNPs的水动力学直径。·利用NanoBrook ZetaPlus仪（Brookhaven,New York,NY,USA）测定悬浮在水溶液中的FITC-NSiNPs和FITC-MSiNPs的Zeta电位。·将FITC-NSi NPs和FITC-MSiNPs溶于PBS,观察溶液的分散时间,在365 nm波长的紫外光照射下观察绿色荧光的激发情况。·采用BET方程法测定FITC-MSiNPs的比表面积。采用BJH法计算孔径分布曲线,定义孔径分布曲线的最大值。·通过重金属Ag⁺的循环吸附实验制备MSiNPs-Ag⁺第二部分NSiNPs、MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺暴露对hCECs的细胞毒性作用和机制研究·人角膜上皮细胞（human corneal epithelial cells,hCECs）的培养和鉴定。通过Cell Counting Kit-8（CCK-8）试验检测不同浓度的NSiNPs、MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺对hCECs的细胞活力的影响。·采用流式细胞术检测MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺对hCECs细胞凋亡的影响。·免疫组化分析MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺处理对hCECs中ROS水平和DNA损伤的影响。透射电镜分析MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺对hCECs的亚细胞结构和线粒体结构的影响。·RNA测序（RNA sequencing,RNA-seq）分析MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺对hCECs转录组的影响,筛选MSiNPs-Ag⁺对hCECs的毒性作用的核心通路。第三部分MSiNPs、MSiNPs-Ag⁺暴露导致的大鼠眼表损伤和干眼症状及FBS的治疗作用研究·以FBS为蛋白冠形成的吸附试剂,通过吸附实验检测并区分MSiNPs和NSiNPs的蛋白冠形成能力·通过一周的重复眼刺激暴露实验,分析浓度为100μg/ml的MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺对Sprague-Dawley（SD）大鼠角膜的损伤和干眼症状的作用。角膜荧光素染色法检测大鼠角膜损伤情况,前节OCT评估MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺的角膜损伤差异。·免疫组化角膜铺片TUNEL染色检测MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺对大鼠角膜上皮细胞凋亡的影响。结果:第一部分NSiNPs、MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺的制备和表征·通过合成获得NSiNPs和MSiNPs,再经过重金属吸附法获得MSiNPs-Ag⁺。在扫描电镜下发现NSiNPs和MSiNPs的平均粒径均为～80 nm。NSiNPs和MSiNPs在水中的水动力直径分别为～80 nm和～86.3nm。NSiNPs和MSiNPs的Zeta电位分别为-57.6 mV和-32.2 mV。在透射电镜下可以看到MSiNPs有明显的空隙,通过紫外灯照射可观察到NSiNPs和MSiNPs均有FITC耦合,能激发绿色荧光,且在PBS中完全溶解,没有凝聚,有良好的分散性。·MSiNPs通过BET方法测定比表面积为238.9 m²/g,通过BJH方法测定总孔隙体积为0.3 cm³/g。第二部分NSi NPs、MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺暴露对hCECs的细胞毒性和机制研究·从人角膜组织块中原代分离培养的hCECs具有紧密连接和鹅卵石样结构,角膜上皮细胞特异性标记物CK12和CK15的阳性率为100%,表明培养的细胞为纯的hCECs。·相差显微镜观察证实,hCECs的细胞死亡随着NPs浓度的增加而增加,100μg/mL的MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺暴露均可导致hCECs细胞死亡,且暴露于MSiNPs-Ag⁺导致的死亡细胞数量明显多于同浓度的MSiNPs。流式细胞分析发现,MSiNPs-Ag⁺导致的hCECs细胞凋亡比例显著高于同浓度的MSiNPs。·CCK检测发现,NSiNPs处理对hCECs没有明显的细胞毒性,而粒径相同的MSiNPs处理hCECs从100μg/mL的浓度开始即可产生显著的细胞毒性,且存在明显剂量依赖关系。当经过浓度为12.5μg/m L的MSiNPs-Ag⁺处理后,hCECs细胞活力显著降低,提示MSiNPs具有一定的角膜细胞毒性,吸附了Ag⁺后其角膜细胞毒性显著升高。·MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺处理hCECs后,活细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）平均荧光强度均显著高于对照组。与MSiNPs处理组相比,MSiNPs-Ag⁺组的ROS水平增高更明显。采用γ-H2AX检测DNA损伤,结果显示MSiNPs处理导致hCECs红色荧光信号较对照组增加,MSiNPs-Ag⁺处理导致hCECs的红色荧光强度较同浓度的MSiNPs显著增强,提示MSiNPs-Ag⁺对hCECs的DNA损伤更严重。·透射电镜观察到暴露在MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺后hCECs内均出现线粒体损伤,其中以MSiNPs-Ag⁺导致的hCECs线粒体损伤尤为严重,同时出现hCECs核膜严重溶解,染色质凝集等。上述结果提示,MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺诱导hCECs的细胞毒性可能通过线粒体损伤、过多ROS的生成和DNA损伤进而导致的细胞凋亡增加,其中MSiNPs-Ag⁺的毒性作用可能比MSiNPs本身更明显。·RNA-seq分析显示,与对照组相比,MSiNPs组hCECs内有1503个差异表达基因（differentially Expressed Genes,DEGs）,其中上调基因854个,下调基因649个。而MSiNPs-Ag⁺组有5157个差异表达基因,其中2609个上调,2548个下调。·京都基因和基因组百科全书（KEGG）途径和蛋白质-蛋白质相互作用分析结果表明:在MSiNPs处理的hCECs的全基因中,PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路可能在诱导细胞毒性中发挥关键作用,而在MSiNPs-Ag⁺处理的hCECs的差异表达基因中,除了凋亡和氧化应激相关的通路外,转录和翻译相关的通路以及mRNA监测信号通路,发挥关键的作用。第三部分MSiNPs、MSiNPs-Ag⁺暴露导致的大鼠眼表损伤和干眼症状及FBS的治疗作用研究·荧光素钠染色和前节相关断层扫描（Anterior segment-optical coherence tomography,OCT）结果显示,MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺均会对大鼠角膜造成损伤,但是MSiNPs-Ag⁺会引起更严重的角膜损伤。在重复眼刺激暴露期间用FBS滴加治疗,可以减弱MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺对大鼠角膜的损伤。提示FBS处理可以显著逆转MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺暴露的角膜损伤。·通过角膜铺片脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL）染色试验,发现MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺重复眼刺激角膜可诱导大鼠角膜中出现大量细胞凋亡,其中暴露于MSiNPs-Ag⁺的大鼠角膜中TUNEL阳性细胞数量显著大于同浓度的MSiNPs,证实MSiNPs-Ag⁺可能比MSiNPs能导致更严重的细胞凋亡。FBS处理明显减少了TUNEL阳性的凋亡细胞,提示FBS可以翻转MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺暴露导致的角膜细胞凋亡。·干眼症试验泪膜破裂时间（The tear film breakup time,TBUT）和基础泪液分泌试验（Schirmer I test,SIT）试验发现,MSiNPs-Ag⁺组暴露相比MSiNPs组表现出更大的诱发干眼的潜力,表明暴露于大鼠角膜的MSiNPs和MSiNPs-Ag⁺可引起与人干眼症症状相似的眼表改变,而MSiNPs-Ag⁺组可引起更严重的干眼症状。通过FBS治疗发现干眼症检测指标恢复正常,提示FBS有治疗类似于人类干眼症状的能力。·蛋白冠的形成可以对NPs表面进行钝化,从而抑制其表面活性。MSiNPs较对照和NSiNPs具有更强的胎牛血清（Fetal bovine serum,FBS）吸收能力,提示FBS处理后MSiNPs能有效的形成蛋白冠从而阻止NPs进入细胞而产生保护作用。结论:在本研究中,我们评估了具有大表面积的MSiNPs以及吸附Ag⁺后对hCECs和大鼠角膜的毒性作用及相关机制,探讨了一种基于蛋白冠治疗MSiNPs诱导的角膜疾病（如干眼症）的方法。·体外实验证实,即使在安全剂量下,Ag⁺与MSiNPs的结合也比MSiNPs本身具有更显著的毒性。RNA-Seq分析发现,MSiNPs可能是通过氧化应激触发细胞凋亡而对hCECs产生毒性作用,其中MSiNPs-Ag⁺还可以通过影响mRNA监测信号通路而对hCECs产生更严重的细胞毒性作用。·在体内实验发现,在短期内重复暴露于MSiNPs-Ag⁺的大鼠会比暴露于MSiNPs产生更严重的角膜损伤和类似于干眼的症状。FBS可以显著逆转角膜损伤,可能是通过在NPs周围形成蛋白冠而产生的治疗作用。