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?-聚谷氨酸(?-PGA )是一种生物可降解的、水溶性的、对人体无毒的生物高分子,它是由 D-型或 L-谷氨酸单体以α-氨基与 ?-羧基相缩合而成的。?-PGA 具有凝胶、成膜、保湿、粘接、增稠、乳化等功能特性,能够作为增稠剂、吸水保湿剂、防冻剂、,缓释材料、药物载体、生物粘接剂、可降解纤维、高吸水性树脂、生物絮凝剂、重金属吸附剂和动物饲料添加剂。本文利用本实验筛选的枯草芽孢杆菌 PGAN-12 摇瓶发酵生产 ?-PGA,对 ?-PGA 的对照品的制备和 ?-PGA的定量检测、菌体的营养需求和发酵条件进行研究以提高 ?-PGA 的发酵产量和生产强度。论文的主要工作及结论有:(1) ?-PGA对照品的制备和?-PGA检测方法的建立 ?-PGA分离提纯采用超滤后去除小分子, 然后冷冻干燥,得到对照品.并以此作标准曲线来检测发酵液?-PGA的含量。采用凝胶渗透色谱法(GPC法)定量分析 ?-PGA , GPC 条 件 本 检 测 采 用 BEKMAN COULTER System Gold125/166,Pharmacia Biotech SuperoseTM 6尺寸排阻凝胶色谱柱,数据采集及处理采用32 Karat 5.0 version色谱工作站,洗脱液为0.15mol/L NaCl+0.05M 磷酸盐缓冲液(pH 7.2),所用的水均为重蒸水,进样前用0.45μm水性超滤膜过滤。紫外检测波长?=210nm。泵流速为0.4mL/min。用高效液相测定?-PGA的浓度,简单方便,方便快捷,准确性较高。(2)发酵条件优化 发酵所用的种子液成分为:葡萄糖 20g/L,酵母膏 5 g/L ,K2HPO42 g/L,MgSO4 0.25 g/L, 谷氨酸钠 10g/L;pH7.0;种子培养时间为 15 小时,最佳接种量为 1%。PGAN-12 合成 ?-聚谷氨酸的合适碳源为葡萄糖,而 TCA 循环中的有机酸包括柠檬酸均不能使 PGAN-12 合成。最适的氮源是酵母膏。PGAN-12 是谷氨酸依赖型的 ?-PGA 产生菌,在谷氨酸钠浓度为 70g/L 时,?-PGA 取得最大的产量为 18.32g/L,但在谷氨酸钠浓度为 30g/L 时,获得了最大的表观转化率,为62.1%,此时生成 ?-PGA 为 14.2g/L。通过谷氨酸钠,葡萄糖,酵母膏的正交实验,得合适的发酵培养基成分为:葡萄糖 40g/L,酵母膏 8g/L,K2HPO4·3H2O 2 g/L,MgSO4 0.25g/L,谷氨酸钠 40g/L,按此培养基进行发酵,经过 24 小时后,?-PGA<WP=5>达到最高产量,为 18.5g/L,生产强度为 0.77g/L.h。发酵培养基最适初始 pH 利为 7.5。与自然初始 pH 相近;在摇床 220r/min 的情况下,500mL 三角瓶的最佳装液量为 80mL。(3)发酵过程的摇补料研究 以补料工艺来强化 ?-PGA 的生产。丛枯草芽孢杆菌 PGAN-12 摇瓶发酵制备 ?-PGA 的过程曲线可知,葡萄糖是 ?-PGA 产量增长的制约因素,根据这个原则设计补料液成分和浓度,得到合适的补料液的浓度为(每升):葡萄糖 70g,酵母膏 20g,K2HPO4.3H2O 4g,MgSO4 0.5g 谷氨酸钠 70g,补料时取 5mL。在发酵进行到 18h 时补料,发酵经过总共 28h,?-PGA 的产量为 23.8g/L,补料过程中 ?-PGA 生产强度为 0.85g/(L.h)。(4)不同金属离子对 ?-PGA 合成的影响 在生产枯草芽孢杆菌 PGAN-12 发酵制备 ?-PGA 过程中,研究了金属离子Ca2+、Mn2+、Mo6+ 、Mg2+、Co2+、Fe3+ 、K+对 ?-PGA 发酵的影响,通过进行单独离子对发酵影响的研究工作,发现 Ca2+、Mn2+、Mo6+ 、Mg2+、Co2+、K+后在合适的浓度时都能显著提高 ?-PGA 的产量,然后进行各种离子的复配,得到合适的含各种金属离子培养基为:葡萄糖 40g/L,酵母膏 8g/L,谷氨酸钠 40g/L,K2HPO4·3H2O 20 g/L, K2HPO4·3H2O 20g/L,MgSO4 0.1 g/L,MnSO40.12 g/L,CoCl20.02 g/L,CaCl20.6 g/L,(NH4)6Mo7O24 0.25 g/L。 按其配方经过 24 小时的发酵, 产量为 34.5 g/L,产率为 1.44g/(L.h) 。 经过如上研究工作,完整的对 ?-PGA 摇瓶发酵过程进行探索,对发酵机理进行了初探, 得到优化后的发酵培养基和发酵条件,?-PGA 的产量为 34.5g/L,产率高达 1.44g/(L.h), 这么高的生产强度从未报道过。