研究背景腹主动脉瘤（Abdominal Aortic Aneurysm,AAA）是腹主动脉管壁退化和管腔病理性扩张引起的血管疾病,65岁以上人群中患病率可达4%,一旦破裂,死亡率高达65-85%,目前已成为严重危及老年人生命的疾病之一。目前对于腹主动脉瘤的主要干预手段:开放手术人工血管置换（OSR）和覆膜支架腔内修复术（EVAR）。研究发现早期手术修复并没有任何优势,没有显著提高患者的生存率,所以不推荐进行预防性的手术干预。应进行密切的临床随访,但频繁的随访占用医疗资源,还发现一些小腹主动脉瘤患者,随着年龄增大,身体状况日益减退,AAA体积却一直处于增大状态,等达到临床指南推荐手术标准或者AAA出现濒临破裂症状需急诊手术干预时,患者因身体状况差不能耐受手术治疗,因此,探明腹主动脉瘤发生、发展的病理机制,积极寻求抑制腹主动脉瘤发生、发展的药物治疗等非侵袭性治疗手段具有重要的临床意义。目前随着分子生物学的发展,普遍认为AAA的发生是多种因素（如吸烟、高血压、感染、高血脂、创伤等）引起腹主动脉管壁受损,免疫反应异常激活,引起动脉管壁炎症细胞浸润、诱导内皮细胞表达黏附分子、趋化单核细胞及其它炎性细胞向外膜浸润、炎性因子异常高表达,导致管壁基质降解蛋白酶表达升高、活性增强,引起弹力纤维降解、胶原纤维异常增生和平滑肌细胞凋亡,促进ECM降解、重塑,引起管壁弹性减退,外加管腔内动脉血流的应力冲击,管壁逐渐扩张,最终形成AAA。因此,管壁炎症被认为是腹主动脉瘤发生、发展的重要因素之一。研究发现晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation end products,RAGE）在炎症性血管疾病中可能起重要作用,RAGE是一种跨膜蛋白,位于细胞膜表面,RAGE有三个结构域,包括胞外域、跨膜域及羧基末端胞内域,胞外域与配体结合后,信号传导至胞内,完成信号传导。正常生理条件下,RAGE在多种细胞表面以极低的浓度存在,但病理性状态下,其表达浓度会显著增加,从而导致和促进多种炎症相关的病理状态改变。同时发现RAGE还有一种缺乏跨膜结构的可溶亚型RAGE（soluble RAGE sRAGE）,它由金属蛋白酶溶蛋白性裂解导致细胞表面RAGE脱落产生剪切性RAGE（cRAGE）和选择性mRNA剪接产生内源分泌性RAGE（esRAGE）组成。sRAGE缺乏跨膜域、胞内域,无法完成信号传导,但可竞争性结合配体,抑制RAGE作用。目前针对RAGE为靶点的治疗,可减轻组织损伤已有相关报道,但对于RAGE是否参与腹主动脉瘤的发生、发展,目前国内外尚未见文献报道。我们将在本研究中对RAGE是否参与腹主动脉瘤发生、发展和以其为靶点治疗是否能抑制腹主动脉瘤的发生、发展进行研究。ADAM10作为一种膜蛋白酶,与RAGE裂解有关,是一种Ⅰ型跨膜内切酶,负责胞外域脱落的主要脱落酶。通过裂解细胞表面的受体,减少完整RAGE的信号传导,本课题我们将AAA模型小鼠腹腔注射重组人ADAM10蛋白,研究其在AAA发生、发展中的作用。小鼠腹主动脉腔内灌注模型（PPE灌注模型）即通过PE-10管灌注猪Ⅰ型弹力蛋白酶至小鼠腹主动脉管腔,降解管壁弹力纤维,减弱管壁弹性,引起炎性细胞浸润聚集,此模型最大优势即接近人体AAA瘤壁病理炎性改变的特点。在本研究中,首先检测人腹主动脉瘤壁RAGE表达,探索其与AAA管壁炎症关系。同时我们将在动物模型中进行验证,阐明RAGE在腹主动脉瘤发生、发展中作用及机制。然后针对RAGE为靶点治疗,检验其对小鼠AAA模型的影响及作用机制。为腹主动脉瘤的临床治疗提供崭新的理论依据和治疗线索。研究目的第一部分:探索RAGE在健康成人、腹主动脉瘤患者的血清及腹主动脉管壁标本组织表达,探索血清可溶性RAGE表达水平与瘤壁炎性因子表达水平的相关性及瘤壁组织RAGE表达与瘤壁炎性因子表达水平相关性。第二部分:利用小鼠AAA模型验证RAGE在小鼠血清及腹主动脉标本组织中表达,探索血清可溶性RAGE表达水平与瘤壁组织炎症因子表达水平的相关性,同时探索小鼠腹主动脉瘤壁组织RAGE表达与瘤壁组织炎性因子表达水平的相关性,并探索其在腹主动脉瘤发生、发展中具体分子作用机制。第三部分:探索ADAM10对小鼠腹主动脉瘤壁炎症反应和腹主动脉瘤发生、发展的影响及机制。研究方法第一部分1.1实验用腹主动脉瘤标本来自AAA患者于山东省立医院血管外科行开放手术时取得,同时抽取患者血清。对照组血清收集于健康成人（未发现AAA）。对照组正常腹主动脉来于器官捐献者（未发现AAA）,肝、肾移植术时器官残留的部分正常腹主动脉组织,均在山东省立医院手术。本研究通过了山东省立医院伦理委员会批准。1.2 ELISA 技术检测血清中 sRAGE 表达;RT-PCR、Western-blotting 检测 AAA 瘤壁组织RAGE表达情况;免疫组化、Western-blotting检测瘤壁组织中NF-κB表达;免疫荧光双染色技术检测腹主动脉标本RAGE与NF-κB细胞同源性。1.3通过RT-PCR、Western-blotting检测腹主动脉瘤壁组织炎性因子表达情况,运用Spearson相关系数判定血清sRAGE浓度与瘤壁炎症因子表达水平的相关性及腹主动脉瘤壁组织RAGE表达与瘤壁组织中炎症因子表达的相关性。第二部分2.12.1.1小鼠分Sham组和AAA模型组,术后B超检测肾下腹主动脉直径,HE及EVG染色检测动脉瘤壁病理改变,并判定造模是否成功。2.1.2 ELISA 技术检测小鼠血清 sRAGE、IL-1β、TNF-α表达;RT-PCR、Western-blotting 检测瘤壁 RAGE 表达情况;Western-blotting 检测瘤壁组织中 NF-κB 表达水平;免疫荧光双染检测小鼠腹主动脉瘤模型中RAGE、NF-κB表达及细胞同源性。2.1.3通过RT-PCR、Western-blotting检测小鼠AAA瘤壁组织中炎性因子表达情况,运用Spearson相关系数判定小鼠血清sRAGE浓度与腹主动脉瘤壁炎症因子表达的相关性,小鼠AAA瘤壁RAGE表达和瘤壁炎症因子表达水平的相关性。第二部分2.22.2.1小鼠分Sham组、AAA模型组、RAGE-/-Sham组及RAGE-/-AAA模型组。2.2.2超声检测术后小鼠腹主动脉内径变化;HE、EVG检测动脉瘤壁病理变化;免疫组化检测小鼠腹主动脉标本中CD68+巨噬细胞、CD8+T细胞、CD31+新生血管、α-SMA表达情况,RT-PCR检测腹主动脉管壁组织中RAGE、TNF-α、IL-1β的mRNA表达,Western blotting检测小鼠腹主动脉管壁组织中RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-1β的蛋白表达。第三部分3.1实验分组:AAA模型组、Sham组和ADAM10治疗组。3.2 ELISA实验检测三组小鼠血浆sRAGE表达;超声检测术后小鼠腹主动脉内径变化;HE、EVG检测动脉瘤壁病理变化;免疫组化检测小鼠腹主动脉标本组织中CD68+巨噬细胞表达情况;RT-PCR检测小鼠动脉标本组织RAGE、TNF-α、IL-1β的mRNA表达变化;Western Blotting检测小鼠动脉瘤壁RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-1β的蛋白表达水平变化;免疫荧光双染色检测瘤壁RAGE、NF-κB的表达位置来源及相关性;R-T PCR、Western Blotting及明胶酶谱检测小鼠腹主动脉瘤壁组织中MMP-2/9的mRNA、蛋白表达及其活性。研究结果第一部分1.检测人体血清及腹主动脉瘤标本情况腹主动脉瘤患者血清中TNF-α、IL-1[β均高表达;HE、EVG染色显示腹主动脉瘤壁标本明显炎性细胞浸润、聚集,弹力纤维破坏严重等基本病理变化;免疫组化、Western blotting检测发现动脉瘤壁中NF-κB表达明显升高;RT-PCR、Western blotting检测发现瘤壁标本TNF-α、IL-1β表达明显升高;RT-PCR、Western-blotting检测发现腹主动脉瘤管壁中MMP-2/9的mRNA、蛋白表达均明显升高。2.RAGE在腹主动脉瘤患者血清及腹主动脉瘤壁的表达情况ELISA检测发现AAA患者血清sRAGE表达降低;免疫荧光、RT-PCR及Western blotting检测发现AAA瘤壁组织RAGE表达明显升高;RAGE表达于细胞膜、细胞间隙,免疫荧光双染色显示瘤壁RAGE表达量升高,与NF-κB表达变化具有一致性。3.Spearson相关性分析显示血清sRAGE浓度与瘤壁TNF-α的表达水平呈负相关（R=-0.5911）,与瘤壁IL-1β的表达水平呈负相关（R=-0.6422）。4.Spearson相关性分析显示瘤壁组织中RAGE表达与炎性因子TNF-α表达呈正相关（R=0.6802）,与瘤壁炎性因子IL-1β的表达呈正相关（R=0.6495）。第二部分2.12.1.1超声检测小鼠腹主动脉直径变化及标本HE染色、EVG染色的病理改变均示造模成功。2.1.2 AAA模型小鼠血清sRAGE表达降低,动脉瘤管壁RAGE表达水平升高。2.1.3 AAA模型小鼠腹主动脉管壁炎性细胞（CD68+巨噬细胞、CD8+T淋巴细胞）及炎性相关因子（NF-κB、TNF-α、IL-1β）表达升高。2.1.4 AAA模型组小鼠腹主动脉瘤壁组织MMP-2/9mRNA、蛋白表达均升高。2.1.5 Spearson相关性分析显示AAA模型组小鼠血清sRAGE浓度与腹主动脉瘤壁TNF-α表达呈负相关（R=-0.5030）;与IL-1β的表达呈负相关（R=-0.5566）。2.1.6 Spearson相关性分析显示AAA模型组小鼠动脉瘤壁中RAGE表达与管壁组织中TNF-α表达呈正相关（R=0.5222）;与IL-1β的表达呈正相关（R=0.5018）。第二部分2.22.2.1超声结果RAGE-/-AAA模型组小鼠腹主动脉内径减小。2.2.2 RAGE-/-AAA模型组小鼠腹主动脉管壁炎症减轻。2.2.3 RAGE-/-AAA模型组小鼠腹主动脉管壁平滑肌细胞凋亡及CD31+新生血管增生明显减轻。2.2.4抑制RAGE/NF-κB信号通路抑制了腹主动脉瘤的发生、发展病理过程。第三部分3.1彩超检测示ADAM10治疗可缓解小鼠腹主动脉瘤径增长。3.2 ADAM10治疗后减轻小鼠腹主动脉管壁破坏。3.3 ADAM10治疗后缓解小鼠腹主动脉管壁炎症反应。3.4 ADAM10治疗后小鼠血清中sRAGE表达升高而TNF-α、IL-1β表达降低。3.5 ADAM10治疗后小鼠腹主动脉瘤壁组织RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-1β表达降低。3.6 ADAM10治疗组小鼠腹主动脉瘤壁组织MMP-2/9的mRNA、蛋白表达水平及活性均下降。结论1.RAGE参与腹主动脉瘤发生、发展病理过程,通过活化下游NF-κB信号通路发挥作用。2.ADAM10治疗可抑制腹主动脉管壁炎症反应和腹主动脉瘤的形成、进展,通过胞外切割RAGE阻断信号传导,同时生成物sRAGE竞争性结合配体,发挥竞争性抑制作用,协同抑制腹主动脉瘤发生、发展。