黑色素瘤是一种侵袭性很强的肿瘤,其5年生存率小于5%。随着BRAF和MEK抑制剂、免疫靶向疗法和免疫检查点抑制剂等治疗方法的快速发展,黑色素瘤患者的生存率得到了显著提高。虽然免疫疗法在黑素瘤患者的治疗过程中发挥重要作用,但肿瘤引起的免疫逃逸限制了免疫治疗的效果。人们尚未对肿瘤免疫逃逸有太深入的了解,许多人类癌症对免疫疗法都有抵抗力。micro RNA是真核细胞中一种长度为21～23 nt的内源性非编码RNA。人类肿瘤中有多种micro RNA表达失调,它们在免疫治疗的过程中发挥至关重要的作用。micro RNA在肿瘤的诊断和预后过程中作为重要的生物标志物,可通过靶向多个关键基因参与肿瘤免疫调控。micro RNA可以通过影响肿瘤细胞的免疫原性导致肿瘤的免疫逃逸,还可以通过平衡肿瘤微环境或者调控免疫细胞的生长和发育调节机体的免疫应答。通过对micro RNA调节肿瘤免疫原性和抵抗细胞毒性T细胞介导的杀伤机制的研究,将对免疫治疗的进一步的研究有着重要作用。目的CRISPR/Cas9作为基因编辑领域中一种十分重要的工具,为我们发现更多潜在的肿瘤免疫治疗靶点发挥了重要的作用。利用CRISPR/Cas9全基因组的筛选已经用来寻找肿瘤细胞耐药、肿瘤细胞增殖和迁移的相关基因。由于micro RNA在肿瘤免疫调控中的重要作用,通过设计CRISPR/Cas9 micro RNA文库无偏的寻找抵抗细胞毒性T细胞杀伤相关的micro RNA,将为黑色素瘤的免疫治疗提供潜在的靶点。方法1.设计了全基因组micro RNA相关的sg RNA文库,得到质控合格的CRISPR/Cas9文库。2.首先使用低病毒感染复数感染表达Cas9的A375细胞系,采用嘌呤霉素来筛选,得到micro RNA敲除细胞系。利用梯度离心法和免疫磁珠筛选,获得细胞毒性T细胞。通过细胞毒性T细胞对感染文库病毒的A375 Cas9细胞系进行筛选。筛选完成后,提取基因组保证文库的丰度,对sg RNA靶向的区域进行PCR扩增。二代测序完成后,使用MAGe CK VISPR来评价样本的测序质量。质控合格后,使用MAGe CK工具对样本的sg RNA进行计数和标准化处理,并使用MAGe CK RRA计算实验组与对照组间sg RNA的富集差异,得到最终的筛选结果。3.通过有限稀释法,经过扩大培养得到稳定敲除micro RNA18a的单克隆株,并对敲除的细胞系进行RNA-SEQ分析。在RNA-SEQ的分析过程中,首先确定基因的表达量,利用Bioconductor DESeq2工具计算实验组与对照组之间的差异表达基因。最终将得到的实验组与对照组之间重叠的差异基因进行比较,在重叠的差异基因中寻找micro RNA18a抵抗细胞毒性T细胞杀伤的相关基因。采用GO富集分析和KEGG信号通路分析来预测micro RNA106b作用的靶基因。结果1.根据文库设计的相关策略,合成了CRISPR/Cas9 micro RNA文库。一共设计了2196个micro RNA相关的sg RNA的文库,该文库涵盖了最新最全的micro RNA。根据二代测序结果,设计的CRISPR/Cas9 micro RNA文库完全匹配率为83.8%,覆盖率为100%,均一性为4,覆盖倍数为162。2.筛选完成之后,对筛选结果进行质控分析。MAGe CK VISPR和Fast QC结果显示,sg RNA提取结果准确,质量与均一性良好。通过MAGe CK RRA分析,我们选择了正向筛选结果中sg RNA富集差异最明显的micro RNA18a和micro RNA106b作为后续研究对象。3.成功构建了micro RNA18a的单克隆细胞系,并对敲除的细胞系进行了RNA-SEQ分析。在micro RNA18a敲除的两个单克隆细胞系的RNA-SEQ分析结果进行重叠。经过RNA-SEQ分析和靶基因预测,micro RNA18a可能通过靶向THBS1,影响细胞毒性T细胞对黑色素瘤细胞的杀伤。最后,通过GO富集分析和KEGG信号通路分析,讨论了micro RNA106b可能发挥的作用。结论1.成功构建了2196个micro RNA相关的sg RNA的文库,该文库几乎涵盖了最新最全的micro RNA,并为以后进行相关micro RNA的筛选打下了坚实的基础。2.micro RNA18a敲低之后,可能通过上调THBS1的表达,影响黑色素瘤的EMT过程,进而影响细胞毒性T细胞对黑色素瘤细胞的杀伤。