论文部分内容阅读
目的芦丁是存在于中蔬菜和水果中的一种常见的黄酮类化合物,近年来研究表明,黄酮类化合物在骨发育和骨代谢中发挥重要的作用,芦丁作为常见黄酮类化合物的代表,对细胞增殖和骨骼发育有重要的影响。本研究旨在探讨芦丁对牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响,并探讨芦丁在这些过程中发挥作用的相关机制,为使用芦丁再生牙周组织和骨组织提供理论基础和应用指导,为黄酮类化合物在牙周组织再生工程中应用提供参考依据。方法采用酶消化法分离培养牙周膜干细胞,使用流式细胞术和多向分化法检测牙周膜干细胞(PDLSCs)的干性。通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测芦丁对牙周膜干细胞增殖活性的影响。采用碱性磷酸酶(ALP)活性测定、碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色等方法检测芦丁对牙周膜干细胞的成骨分化能力的影响。使用定量聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫蛋白印迹(Western blot)来检测成骨相关基因和相关蛋白的表达情况。为了探究这些过程的相关机制,通过免疫蛋白印迹(Western blot)检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白AKT、p-AKT、mTOR 和 p-mTOR 以及 G 蛋白偶联受体 30(GPR30),并使用 LY294002(PI3K信号通路抑制剂)和G15(GPR30的选择性拮抗剂)进一步验证GPR30/PI3K/AKT/mTOR信号通路在芦丁发挥促增殖和成骨作用时所起到的作用。结果通过酶消化法成功地分离了牙周膜干细胞,流式细胞术鉴定结果显示牙周膜干细胞对间充质干细胞(MSCs)特异性表面标志物呈阳性,且牙周膜干细胞具有多分化潜能。CCK-8增殖测试结果显示,芦丁增强了牙周膜干细胞的增殖活性。ALP活性测试,ALP染色和茜素红染色等结果显示,芦丁增强了牙周膜干细胞的ALP活性和矿化基质的分泌,以及促进了矿化结节的形成。此外,RT-PCR和免疫蛋白印迹结果表明,芦丁显著增强了牙周膜干细胞的成骨基因和蛋白的表达,同时提高了 PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白AKT和mTOR的磷酸化水平。使用PI3K信号通路抑制剂LY294002处理牙周膜干细胞,p-AKT、p-mTOR和成骨蛋白/基因的表达均呈现出下降的趋势。此外,在芦丁发挥作用过程中,检测到芦丁可以促进G蛋白偶联受体30(GPR30)的表达,加入GAPR30的选择性拮抗剂G15后,芦丁发挥的促进作用明显降低,并且同时阻断了 PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活,GPR30是PI3K/AKT/mTOR信号的一个上游调节蛋白。结论芦丁通过激活GPR30/PI3K/AKT/mTOR信号通路促进PDLSCs的增殖和成骨分化,芦丁有望在牙周组织工程和骨再生中发挥重要作用。