第一部分人退变髓核组织mi RNA芯片与mi R-210表达分析目的:椎间盘退变(IDD)是引起下腰痛最常见的原因,但其发病机制仍未完全阐明。本研究应用micro RNA(mi RNA)芯片技术检测人退变的髓核(NP)组织中差异表达的mi RNAs,初步筛选出与IDD相关的mi RNAs,并通过实时定量PCR(q RT-PCR)对某些差异表达的mi RNA进行验证,为进一步探讨mi RNA在IDD发生、发展中的作用奠定基础,也为椎间盘退行性疾病的防治提供新的靶点。方法:收集术中常规切除的5个正常NP组织标本(Grade II)及45个退变的NP组织标本(Grade III、IV、V分别为15个),从45个退变的NP组织标本中选择5个(Grade III、IV、V分别为1、2、2个),利用Sure Print Human mi RNA Microarrays(8′60K)V16芯片检测这5个退变的NP组织标本及所有正常NP组织标本中mi RNAs表达。根据mi RNA芯片结果,以上述50个NP组织标本为研究对象,对某些差异表达的mi RNAs用q RT-PCR验证,并对差异表达的mi RNA水平与Pfirrmann分级进行相关性分析。结果:通过对芯片进行图像扫描和数据分析,筛选获得29个与IDD相关mi RNAs,其中20个表达上调(Fold change≥2),即Hsa-mi R-22-3p、Hsa-mi R-21、Hsa-mi R-338-3p、Hsa-mi R-320a、Hsa-mi R-372、Hsa-mi R-744、Hsa-mi R-122a、Hsa-mi R-146a、Hsa-mi R-181c、Hsa-mi R-508-5p、Hsa-mi R-93-5p、Hsa-mi R-133b、Hsa-mi R-210、Hsa-let-7g-5p、Hsa-mi R-187、Hsa-mi R-451a、Hsa-mi R-659、Hsa-mi R-30-5p、Hsa-mi R-7-5p和Hsa-mi R-155,其中Hsa-mi R-210显著上调(Fold change≥5),9个表达下调(Fold change≤0.5),即Hsa-mi R-212-5p、Hsa-mi R-10a-5p、Hsa-mi R-31、Hsa-mi R-375、Hsa-mi R-138、Hsa-mi R-129-3p、Hsa-mi R-147b、Hsa-mi R-33a和Hsa-let-7c。q RT-PCR结果表明mi R-210在人退变的NP组织中表达明显升高(P<0.05),与芯片结果相符,而且mi R-210表达水平Pfirrmann分级呈正相关(r=0.67,P<0.05)。小结:(1)人退变NP组织中存在多个差异表达的mi RNAs,其中mi R-210表达显著上调。这些mi RNAs可能与IDD的发生、发展有关;(2)q RT-PCR证实mi R-210在人退变NP组织中呈高表达,并与Pfirrmann分级呈正相关,提示mi R-210可能在IDD发病机制中起重要作用。第二部分人正常和退变髓核细胞的分离、培养目的:熟练掌握人正常和退变NP细胞的培养方法、为后续实验的顺利开展奠定实验基础。方法:应用0.25%的胰酶+0.2%II型胶原(Col II)联合消化法从中老年腰椎间盘突出(LDH)及青壮年腰椎爆裂性骨折(LVF)患者手术切除的NP组织标本中进行NP细胞的分离、培养,并进行传代,倒置相差显微镜下观察细胞形态。取第2代正常及退变的NP细胞,对ColⅡ、聚集蛋白聚糖(aggrecan)分别进行免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色,q RT-PCR检测ColⅡ、aggrecan m RNA表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法分析培养1、2、3、4d时的增殖能力,以鉴定所培养的细胞是否为NP细胞。结果:倒置相差显微镜下,原代及第1、2代细胞代谢旺盛,增殖能力相对较强,但从传第3代后,细胞出现老化现象。免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色及q RT-PCR显示,第2代正常NP细胞含有大量的Col II、aggrecan,但退变的NP细胞其含量明显降低(P<0.05)。MTT法表明退变NP细胞培养2、3、4d时的增殖能力低于正常NP细胞(P<0.05),从而证实所培养的细胞为NP细胞。小结:(1)应用0.25%的胰酶+0.2%ColⅡ联合消化法成功培养出人正常、退变NP细胞;(2)第1、2代NP细胞适合用于体外实验。第三部分mi R-210通过靶向自噬相关基因ATG7促进人退变髓核细胞ECM降解目的:Col II、aggrecan为椎间盘ECM的主要成分,主要被基质金属蛋白酶(MMP)-3、MMP-13降解,它们的含量降低是IDD的典型病理特征。自噬是调控椎间盘ECM代谢的重要途径。自噬相关基因7(ATG7)与自噬泡形成过程密切相关,同时也是mi R-210的靶基因,但mi R-210是否通过ATG7调控NP细胞自噬及ECM降解尚不清楚。本部分拟研究mi R-210对人退变NP细胞自噬、ECM降解的影响及作用机制。方法:通过生物信息学方法验证mi R-210与ATG7的结合情况。构建野生型psi CHECKTM-2-ATG7-WT 3′UTR和突变型psi CHECK?-2-ATG7-Mut 3′UTR重组质粒,并与mi R-210 mimic共转染至HEK 293T细胞,检测荧光素酶报告基因的活性。培养人正常、退变的NP细胞,采用q RT-PCR和Western blot测定两种细胞内mi R-210、ATG7表达。后续实验以人退变NP细胞为研究对象,用不同浓度的mi R-210 mimic(0、10、20、40、80 n M)处理细胞24 h或以40 n M mi R-210mimic处理细胞不同时间(0、6、12、24、48 h)后,通过q RT-PCR、Western blot分别检测ATG7 m RNA、蛋白表达;选择40 n M mi R-210 inhibitor、mimic转染细胞24h,单丹磺酰戊二胺(MDC)染色观察自噬泡,Western blot测定微管相关蛋白1轻链3(LC3)-II/LC3-I比值和beclin表达,q RT-PCR、Western blot检测MMP-3、MMP-13、Col II、aggrecan表达;ATG7小干扰RNA(si RNA)或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)预处理细胞后,再以40 n M mi R-210 inhibitor转染细胞,q RT-PCR、Western blot检测MMP-3、MMP-13、Col II、aggrecan表达,进一步评价自噬在mi R-210调控ECM降解中的作用。结果:生物信息学分析显示,人ATG7 m RNA 3′UTR中存在多个mi R-210结合位点,且二者结合的自由能(-20.5kal/mol)较低。野生型psi CHECKTM-2-ATG7-WT 3′UTR与mi R-210 mimic共转染后减少荧光素酶活性(P<0.05)。相对于正常NP细胞,人退变NP细胞mi R-210表达上调(P<0.05),而ATG7表达下调(P<0.05)。mi R-210 mimic呈浓度和时间依赖性降低人退变NP细胞ATG7m RNA与蛋白水平(P<0.05)。用mi R-210 mimic转染人退变NP细胞后,自噬泡形成减少,自噬细胞百分率、LC3-II/I比值及beclin-1、Col II、aggrecan表达量降低,而MMP-3、MMP-13表达量升高,与对照组比较,差异均有显著性(P<0.05),mi R-210 inhibitor的作用则相反(P<0.05)。ATG7 si RNA或3-MA预处理细胞后再以40 n M mi R-210 inhibitor转染可部分逆转mi R-210 inhibitor诱导的MMP-3、MMP-13表达下调和Col II、aggrecan表达上调(P<0.05)。小结:(1)人退变NP细胞存在mi R-210高表达和ATG7低表达;(2)mi R-210具有靶向抑制人退变NP细胞ATG7 m RNA与蛋白表达的作用;(3)mi R-210通过抑制ATG7降低人退变NP细胞自噬水平,使MMP-3、MMP-13表达上调,并促进随后的Col II、aggrecan降解。第四部分mi R-210靶向沉默Bcl-2促进人退变髓核细胞凋亡目的:凋亡所致的NP细胞数量减少在IDD发生、发展中起重要作用。Bcl-2是最重要的凋亡抑制因子,但mi R-210是否通过Bcl-2影响NP细胞凋亡仍不清楚。因此,本部分拟研究mi R-210对人退变NP细胞Bcl-2表达及凋亡的影响。方法:运用生物信息学方法分析mi R-210与Bcl-2的结合情况。构建野生型psi CHECKTM-2-Bcl-2-WT 3′UTR和突变型psi CHECK?-2-Bcl-2-Mut 3′UTR重组质粒,并与mi R-210 mimic共转染至HEK 293T细胞,检测荧光素酶报告基因的活性。培养人正常、退变的NP细胞,采用q RT-PCR和/Western blot测定两种细胞内mi R-210、Bcl-2表达。随后以人退变NP细胞为研究对象,经不同浓度的mi R-210 mimic(0、10、20、40、80 n M)处理细胞24 h或以40 n M mi R-210 mimic处理细胞不同时间(0、6、12、24、48 h)后,通过q RT-PCR、Western blot检测Bcl-2 m RNA与蛋白表达。根据浓度和时间依赖性实验结果,选择40 n M mi R-210 mimic转染人退变NP细胞24h,流式细胞术分析细胞凋亡率,Western blot检测Bax、cleaved caspase-3蛋白表达。结果:生物信息学分析显示,人Bcl-2 m RNA 3′UTR中存在多个mi R-210结合位点,且二者结合的自由能(-20.5kal/mol)较低。野生型psi CHECKTM-2-Bcl-2-WT 3′UTR与mi R-210 mimic共转染后减少荧光素酶活性(P<0.05)。相对于正常NP细胞,人退变NP细胞mi R-210表达上调(P<0.05),而Bcl-2表达下调(P<0.05)。mi R-210 mimic呈浓度和时间依赖性降低人退变NP细胞Bcl-2m RNA与蛋白水平(P<0.05)。mi R-210 mimic转染人退变NP细胞对Bax蛋白含量无影响(P>0.05),但增加caspase-3活性(P<0.05)。小结:(1)mi R-210具有靶向抑制人退变NP细胞Bcl-2 m RNA与蛋白表达的作用;(2)mi R-210过表达通过降低Bcl-2/Bax比值和激活caspase-3诱导人退变NP细胞凋亡。