论文部分内容阅读
第一部分:CaSR在UPEC感染的大鼠睾丸巨噬细胞中表达升高
【目的】探究在UPEC诱导的大鼠睾丸炎模型中，TM中CaSR的表达情况。
【方法】从湖北省疾控中心购买250-300kg的Wistar雄性大鼠构建UPEC睾丸炎模型，收集其睾丸组织、睾丸间质液和血液标本。首先，用LB无抗生素细菌培养基摇UPEC菌液过夜，酶标仪检测UPEC菌液浓度；从大鼠两侧输精管逆行注射菌液后缝合伤口。等量的生理盐水注射作为对照组。7天后确认UPEC睾丸炎模型是否构建成功，实验方法有UPEC基因PAPC及菌落的鉴定，睾丸HE染色，以及电镜下寻找睾丸中UPEC细菌。确认模型构建成功后，取新鲜的睾丸分离出TM，鉴定细胞的纯度，检测巨噬细胞内CaSR的表达情况。
【结果】模型构建7天后，UPEC组大鼠睾丸匀浆中明显含有UPEC细菌PAPC基因；且将UPEC组睾丸匀浆涂平板后，次日肉眼可见大量UPEC细菌菌落生成，而对照组平板无细菌菌落生长。电镜下在UPEC感染组大鼠睾丸间质中发现UPEC细菌。肉眼可见UPEC感染组Wistar大鼠睾丸体积与质量较生理盐水对照组相比均减少；精子前向运动率和精子总数与生理盐水对照组相比均降低，精子质量明显受到影响。在睾丸组织中，结果显示，CaSR在正常的大鼠睾丸组织中表达，且感染UPEC后CaSRmRNA与蛋白水平明显升高。TM的RT-PCR与WB结果同样显示，CaSR在UPEC感染组TM中大量表达。
【结论】UPEC大鼠睾丸炎模型构建成功；无论是在基因水平还是蛋白水平，UPEC促进CaSR在TM中表达增加。
第二部分:CaSR通过Ca2+激活NLRP3通路促进IL-1β的分泌
【目的】本部分在UPEC促进CaSR在睾丸巨噬细胞表达增加的基础上，我们进一步研究CaSR在睾丸炎机制中的作用，探索了感染性睾丸炎的天然免疫机制。
【方法】构建UPEC大鼠睾丸炎模型，分为生理盐水对照组，UPEC感染组，CaSR抑制剂NPS2143阴性对照组以及UPEC+NPS2143抑制剂组。第一天我们按照第一部分的实验方法构建生理盐水对照组大鼠10只，UPEC感染组20只。次日取10只UPEC感染组大鼠，在睾丸原位注射CaSR抑制剂NPS-2143以构建UPEC+NPS2143抑制剂组。然后在10只生理盐水对照组及10只UPEC感染组大鼠睾丸中原位注射等体积的DMSO(NPS-2143溶剂)，另构建10只NPS-2143阴性对照组。通过HE染色观察睾丸组织学变化；取附睾尾部精子分析精子总数及前向运动；运用质谱的方法检测各组大鼠血清中睾酮的水平并进行分析；我们通过fluo4-am荧光标记的流式法和酶标仪法检测各组大鼠巨噬细胞内钙离子的情况；通过ELISA方法检测睾丸间质液与原代TM上清液中IL-1β的分泌情况；然后，在体外实验中，先分离出正常的大鼠睾丸巨噬细胞，再在细胞培养基中用细菌UPEC体外刺激0min、30min、60min、120min，检测刺激后TM中CaSR与NLRP3的基因表达水平。同时在体内实验中，分离出原代TM并检测TM中CaSR与NLRP3mRNA表达水平；运用WesternBlot实验方法检测原代睾丸巨噬细胞中NLRP3蛋白和Caspase-1蛋白的表达情况。
【结果】UPEC感染组睾丸组织切片表现出明显的炎性损伤，包括生精上皮排列不规则且层数减少以及间质中免疫细胞的浸润；值得一提的是，UPEC+NPS-2143抑制剂组大鼠睾丸的炎性损伤有所缓解；NPS-2143阴性对照组较生理盐水对照组未见明显的变化。UPEC感染后大鼠精子总数与精子前向运动率与对照组相比明显下降，而使用CaSR抑制剂NPS-2143后精子总数与精子前向运动率有所提高。正常情况下，大鼠血清中睾酮的水平约为4.5ng/mL，UPEC感染后大鼠睾酮的水平约下降3倍，经过CaSR抑制剂NPS-2143干预后，与UPEC感染组相比睾酮的水平约升高了1倍。体内实验流式结果显示，与对照组相比，UPEC组原代巨噬细胞胞浆内含有大量的钙离子内流(P＜0.01)，使用CaSR抑制剂NPS-2143后钙离子内流减少(P＜0.05)。酶标仪检测巨噬细胞胞浆钙离子水平的结果显示UPEC+NPS-2143组中钙离子的水平较UPEC感染组相比下降(P＜0.05)。体外实验结果显示，细菌UPEC体外刺激的最佳时间是60min，UPEC刺激后TM中CaSR与NLRP3的基因水平均明显升高。WesternBlot结果显示，UPEC感染后大鼠睾丸原代巨噬细胞中NLRP3的蛋白水平明显增加，而CaSR抑制剂可以抑制NLRP3蛋白的表达。
【结论】异常增高的CaSR是造成UPEC睾丸炎性损伤的重要因素之一，对精子活力、精子总数、睾丸结构以及血清睾酮的水平产生负面影响，然而CaSR抑制剂NPS-2143可以在一定程度上缓解这些炎性损伤；在UPEC感染后，睾丸巨噬细胞内CaSR可能通过促进钙离子内流激活NLRP3炎性小体通路。
第三部分:PK2通过CaSR调控Ca2+激活NLRP3通路增加IL-1β的分泌
【目的】本部分在睾丸巨噬细胞中PK2激活NLRP3炎性小体通路从而引起IL-1β表达升高的基础上，探索CaSR在PK2与NLRP3之间的作用。我们猜测PK2可能通过调控钙离子激活NLRP3炎性小体通路。进一步完善睾丸炎天然免疫的机制。
【方法】首先，构建UPEC大鼠睾丸炎模型，分为生理盐水对照组，UPEC感染组，PK2抑制剂PKR-A阴性对照组以及UPEC+PKR-A抑制剂组，每组个10只Wistar大鼠。参照第二部分实验方法构建UPECWistar大鼠睾丸炎模型，UPEC+NPS2143抑制剂组是指次日在UPEC感染的大鼠睾丸中原位注射PK2抑制剂PKR-A，其中PKR-A用5%的DMSO溶解，因此在余下各组模型鼠睾丸中原位注射等体积的DMSO。建立睾丸炎模型后，分离出原代睾丸巨噬细胞。在睾丸原代巨噬细胞中对PK2与CaSR进行荧光定位。观察各组睾丸组织学的改变；运用质谱的方法检测各组大鼠血清中睾酮的水平并进行分析，同时提取原代间质细胞，通过以下分组(Control、IL-1β、
LPS+UPEC、LPS+UPEC+PK2、PK2、anti-IL-1β)刺激间质细胞，检测各组中睾酮激素的水平。通过ELISA方法检测各组睾丸间质液中IL-1β的分泌情况。分别使用
NLRP3、PK2、Caspase-1以及CaSR的抑制剂处理睾丸原代巨噬细胞后，收集细胞上清液检测IL-1β的表达，其中分组包括Ctrl、LPS、DMSO、LPS+UPEC+DMSO、LPS+UPEC+NPS2143、LPS+UPEC+MCC950、LPS+UPEC+VX-765以及
LPS+UPEC+PK2+DMSO、LPS+UPEC+PK2+NPS2143、LPS+UPEC+PK2+MCC950、LPS+UPEC+PK2+VX-765组。通过质粒转染的方法过表达间质细胞系(TM3)PK2的水平，以WesternBlot实验方法检测PK2过表达后CaSR蛋白的表达水平。
【结果】PK2也在睾丸原代巨噬细胞核中表达，UPEC刺激细胞核中的PK2分泌至细胞质中。IL-1β的ELISA结果显示，在生理盐水对照组上清液中未检测到IL-1β的水平，UPEC组细胞上清液中IL-1β的分泌水平明显升高，然而PKRA与NPS2143组IL-1β的分泌水平显示下降。在三种抑制剂的作用下，增加PK2的水平，炎性作用也随着PK2的水平升高，而NPS2143能抑制炎症细胞因子IL-1β的分泌，但NPS2143抑制炎症细胞因子IL-1β的效率并没有随着PK2的升高而增加，NPS2143抑制PK2促进IL-1β分泌。大鼠血清中LC-MS的结果显示，与CaSR抑制剂效果一致，使用PKR-A抑制剂同样能促进睾丸激素的产生；体外试验LC-MS的结果显示，在对照组中可以检测到睾丸激素，但是一些处理组(100nMIL-1β，LPS+UPEC，LPS+UPEC+10nMPK2)上清液中睾丸激素的含量低于检测限，未显示相应的结果。从转染PK2的细胞中提取总蛋白WB结果显示，过表达PK2的细胞中CaSR蛋白的表达明显增高。
【结论】PK2能进一步促进睾丸巨噬细胞内NLRP3炎性小体通路上相关因子蛋白水平的表达升高，诱导TM分泌更多的促炎性因子IL-1β；PK2通过CaSR调控Ca2+激活NLRP3通路增加IL-1β的分泌。
【目的】探究在UPEC诱导的大鼠睾丸炎模型中，TM中CaSR的表达情况。
【方法】从湖北省疾控中心购买250-300kg的Wistar雄性大鼠构建UPEC睾丸炎模型，收集其睾丸组织、睾丸间质液和血液标本。首先，用LB无抗生素细菌培养基摇UPEC菌液过夜，酶标仪检测UPEC菌液浓度；从大鼠两侧输精管逆行注射菌液后缝合伤口。等量的生理盐水注射作为对照组。7天后确认UPEC睾丸炎模型是否构建成功，实验方法有UPEC基因PAPC及菌落的鉴定，睾丸HE染色，以及电镜下寻找睾丸中UPEC细菌。确认模型构建成功后，取新鲜的睾丸分离出TM，鉴定细胞的纯度，检测巨噬细胞内CaSR的表达情况。
【结果】模型构建7天后，UPEC组大鼠睾丸匀浆中明显含有UPEC细菌PAPC基因；且将UPEC组睾丸匀浆涂平板后，次日肉眼可见大量UPEC细菌菌落生成，而对照组平板无细菌菌落生长。电镜下在UPEC感染组大鼠睾丸间质中发现UPEC细菌。肉眼可见UPEC感染组Wistar大鼠睾丸体积与质量较生理盐水对照组相比均减少；精子前向运动率和精子总数与生理盐水对照组相比均降低，精子质量明显受到影响。在睾丸组织中，结果显示，CaSR在正常的大鼠睾丸组织中表达，且感染UPEC后CaSRmRNA与蛋白水平明显升高。TM的RT-PCR与WB结果同样显示，CaSR在UPEC感染组TM中大量表达。
【结论】UPEC大鼠睾丸炎模型构建成功；无论是在基因水平还是蛋白水平，UPEC促进CaSR在TM中表达增加。
第二部分:CaSR通过Ca2+激活NLRP3通路促进IL-1β的分泌
【目的】本部分在UPEC促进CaSR在睾丸巨噬细胞表达增加的基础上，我们进一步研究CaSR在睾丸炎机制中的作用，探索了感染性睾丸炎的天然免疫机制。
【方法】构建UPEC大鼠睾丸炎模型，分为生理盐水对照组，UPEC感染组，CaSR抑制剂NPS2143阴性对照组以及UPEC+NPS2143抑制剂组。第一天我们按照第一部分的实验方法构建生理盐水对照组大鼠10只，UPEC感染组20只。次日取10只UPEC感染组大鼠，在睾丸原位注射CaSR抑制剂NPS-2143以构建UPEC+NPS2143抑制剂组。然后在10只生理盐水对照组及10只UPEC感染组大鼠睾丸中原位注射等体积的DMSO(NPS-2143溶剂)，另构建10只NPS-2143阴性对照组。通过HE染色观察睾丸组织学变化；取附睾尾部精子分析精子总数及前向运动；运用质谱的方法检测各组大鼠血清中睾酮的水平并进行分析；我们通过fluo4-am荧光标记的流式法和酶标仪法检测各组大鼠巨噬细胞内钙离子的情况；通过ELISA方法检测睾丸间质液与原代TM上清液中IL-1β的分泌情况；然后，在体外实验中，先分离出正常的大鼠睾丸巨噬细胞，再在细胞培养基中用细菌UPEC体外刺激0min、30min、60min、120min，检测刺激后TM中CaSR与NLRP3的基因表达水平。同时在体内实验中，分离出原代TM并检测TM中CaSR与NLRP3mRNA表达水平；运用WesternBlot实验方法检测原代睾丸巨噬细胞中NLRP3蛋白和Caspase-1蛋白的表达情况。
【结果】UPEC感染组睾丸组织切片表现出明显的炎性损伤，包括生精上皮排列不规则且层数减少以及间质中免疫细胞的浸润；值得一提的是，UPEC+NPS-2143抑制剂组大鼠睾丸的炎性损伤有所缓解；NPS-2143阴性对照组较生理盐水对照组未见明显的变化。UPEC感染后大鼠精子总数与精子前向运动率与对照组相比明显下降，而使用CaSR抑制剂NPS-2143后精子总数与精子前向运动率有所提高。正常情况下，大鼠血清中睾酮的水平约为4.5ng/mL，UPEC感染后大鼠睾酮的水平约下降3倍，经过CaSR抑制剂NPS-2143干预后，与UPEC感染组相比睾酮的水平约升高了1倍。体内实验流式结果显示，与对照组相比，UPEC组原代巨噬细胞胞浆内含有大量的钙离子内流(P＜0.01)，使用CaSR抑制剂NPS-2143后钙离子内流减少(P＜0.05)。酶标仪检测巨噬细胞胞浆钙离子水平的结果显示UPEC+NPS-2143组中钙离子的水平较UPEC感染组相比下降(P＜0.05)。体外实验结果显示，细菌UPEC体外刺激的最佳时间是60min，UPEC刺激后TM中CaSR与NLRP3的基因水平均明显升高。WesternBlot结果显示，UPEC感染后大鼠睾丸原代巨噬细胞中NLRP3的蛋白水平明显增加，而CaSR抑制剂可以抑制NLRP3蛋白的表达。
【结论】异常增高的CaSR是造成UPEC睾丸炎性损伤的重要因素之一，对精子活力、精子总数、睾丸结构以及血清睾酮的水平产生负面影响，然而CaSR抑制剂NPS-2143可以在一定程度上缓解这些炎性损伤；在UPEC感染后，睾丸巨噬细胞内CaSR可能通过促进钙离子内流激活NLRP3炎性小体通路。
第三部分:PK2通过CaSR调控Ca2+激活NLRP3通路增加IL-1β的分泌
【目的】本部分在睾丸巨噬细胞中PK2激活NLRP3炎性小体通路从而引起IL-1β表达升高的基础上，探索CaSR在PK2与NLRP3之间的作用。我们猜测PK2可能通过调控钙离子激活NLRP3炎性小体通路。进一步完善睾丸炎天然免疫的机制。
【方法】首先，构建UPEC大鼠睾丸炎模型，分为生理盐水对照组，UPEC感染组，PK2抑制剂PKR-A阴性对照组以及UPEC+PKR-A抑制剂组，每组个10只Wistar大鼠。参照第二部分实验方法构建UPECWistar大鼠睾丸炎模型，UPEC+NPS2143抑制剂组是指次日在UPEC感染的大鼠睾丸中原位注射PK2抑制剂PKR-A，其中PKR-A用5%的DMSO溶解，因此在余下各组模型鼠睾丸中原位注射等体积的DMSO。建立睾丸炎模型后，分离出原代睾丸巨噬细胞。在睾丸原代巨噬细胞中对PK2与CaSR进行荧光定位。观察各组睾丸组织学的改变；运用质谱的方法检测各组大鼠血清中睾酮的水平并进行分析，同时提取原代间质细胞，通过以下分组(Control、IL-1β、
LPS+UPEC、LPS+UPEC+PK2、PK2、anti-IL-1β)刺激间质细胞，检测各组中睾酮激素的水平。通过ELISA方法检测各组睾丸间质液中IL-1β的分泌情况。分别使用
NLRP3、PK2、Caspase-1以及CaSR的抑制剂处理睾丸原代巨噬细胞后，收集细胞上清液检测IL-1β的表达，其中分组包括Ctrl、LPS、DMSO、LPS+UPEC+DMSO、LPS+UPEC+NPS2143、LPS+UPEC+MCC950、LPS+UPEC+VX-765以及
LPS+UPEC+PK2+DMSO、LPS+UPEC+PK2+NPS2143、LPS+UPEC+PK2+MCC950、LPS+UPEC+PK2+VX-765组。通过质粒转染的方法过表达间质细胞系(TM3)PK2的水平，以WesternBlot实验方法检测PK2过表达后CaSR蛋白的表达水平。
【结果】PK2也在睾丸原代巨噬细胞核中表达，UPEC刺激细胞核中的PK2分泌至细胞质中。IL-1β的ELISA结果显示，在生理盐水对照组上清液中未检测到IL-1β的水平，UPEC组细胞上清液中IL-1β的分泌水平明显升高，然而PKRA与NPS2143组IL-1β的分泌水平显示下降。在三种抑制剂的作用下，增加PK2的水平，炎性作用也随着PK2的水平升高，而NPS2143能抑制炎症细胞因子IL-1β的分泌，但NPS2143抑制炎症细胞因子IL-1β的效率并没有随着PK2的升高而增加，NPS2143抑制PK2促进IL-1β分泌。大鼠血清中LC-MS的结果显示，与CaSR抑制剂效果一致，使用PKR-A抑制剂同样能促进睾丸激素的产生；体外试验LC-MS的结果显示，在对照组中可以检测到睾丸激素，但是一些处理组(100nMIL-1β，LPS+UPEC，LPS+UPEC+10nMPK2)上清液中睾丸激素的含量低于检测限，未显示相应的结果。从转染PK2的细胞中提取总蛋白WB结果显示，过表达PK2的细胞中CaSR蛋白的表达明显增高。
【结论】PK2能进一步促进睾丸巨噬细胞内NLRP3炎性小体通路上相关因子蛋白水平的表达升高，诱导TM分泌更多的促炎性因子IL-1β；PK2通过CaSR调控Ca2+激活NLRP3通路增加IL-1β的分泌。