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目的： 食管癌是危害人类健康的全球性公共疾病，是具有侵袭和转移特性的恶性肿瘤之一。虽然近些年来在食管癌的诊断和治疗上取得了一些进展，但由于其复发和转移率高，所以食管癌患者预后情况依然不容乐观，其整体生存率不到10％，术后5年生存率也只有20％-40％。目前普遍认为食管癌是多基因相关，多因素作用，多阶段发展的疾病，其发生和发展的内在确切机制仍未完全阐明。人类肿瘤相关死亡的90％原因是由于肿瘤转移，恶性肿瘤转移是一个多步骤的连续过程，存在其规律和器官选择性。多项研究证实，上皮间质转化(Epithelialmesenchymal transition，EMT)在恶性肿瘤侵袭和转移中扮演着重要角色。近年来Cripto-1在肿瘤侵袭和转移中的作用越来越受研究者关注，Cripto-1能够促进肿瘤EMT的发生，从而在肿瘤的发生发展过程中起着重要的癌基因作用。因此，本课题通过研究Cripto-1在食管癌侵袭和转移中的作用及其机制，探讨食管癌发病的分子机制，为其早期诊断及分子靶向治疗提供研究切入点和参考。 方法： 研究Cripto-1在人食管癌组织中的表达及临床意义：收集41例术中食管癌标本，记录患者临床资料，采用免疫组化、Western blot、RT-PCR方法检测人食管癌组织、癌旁组织和正常食管组织中Cripto-1，E-cadherin，N-cadherin，Vimentin的mRNA和蛋白表达，探讨其表达水平与食管癌分化程度和淋巴结转移等之间的关系。 构建并筛选能够有效抑制人食管癌Eca109细胞Cripto-1表达的siRNA序列：分别设计针对Cripto-1靶基因序列的3个siRNA序列，构建重组shRNA质粒，并转染至人食管细胞癌细胞Eca109，以空载体为阴性对照。采用WB和实时荧光定量PCR分别从蛋白和mRNA水平两个水平证实沉默效果，并筛选出干扰效率最高的shRNA。 靶向沉默Cripto-1基因对食管癌EMT的影响：将食管癌细胞Eca109分为干扰组、阴性对照组、空白组。干扰组加入pSilencer2.1-Cripto1-shRNA413，阴性对照组加入pSilencer2.1阴性对照，空白对照组不予任何处理。转染后采用Western blot和实时荧光定量PCR检测E-cadherin，N-cadherin，Vimentin蛋白和mRNA的表达变化情况。 靶向沉默Cripto-1基因表达及联合应用紫杉醇和顺铂对人食管癌细胞增殖、侵袭、周期、调亡的影响，从细胞水平探讨Cripro-1对食管癌生物学行为的影响：将人食管癌细胞Eca109分为5组：干扰组、药物组、干扰+药物组、阴性对照组、空白对照组，干扰组加入pSilencer2.1-Cripto1-shRNA413；药物组加入顺铂+紫杉醇；干扰+药物组加入pSilencer2.1-Cripto1-shRNA413+顺铂+紫杉醇；阴性对照组加入pSilencer2.1阴性对照；空白对照组不予任何处理。平板克隆形成实验(CFA)检测各组食管癌细胞克隆形成能力；流式细胞术(FCM)检测各组细胞周期、凋亡情况；Transwell小室检测各组细胞侵袭、迁移活力。 结果： 免疫组化结果显示Cripto-1在食管癌组织中表达增高，且Cripto-1阳性表达者淋巴结和远处转移发生率高，多为临床中、晚期；Cripto-1阴性表达者淋巴结和远处转移发生率低，多为临床早期。其表达与患者的年龄、性别、浸润深度无显著相关性(P>0.05)，而与淋巴结转移、远处转移及临床分期显著相关(P<0.05)。WB和RT-PCR检测结果显示，在食管癌组织中Cripto-1、N-cad、Vim的蛋白和mRNA表达量均高于癌旁组织及正常食管组织(P<0.05)；而E-cad要低于癌旁组织及正常食管组织(P<0.05)。 成功构建了3个shRNA干扰序列，即pSilencer2.1/Cripto-1shRNA-21，413，619。经荧光PCR定量检测3个shRNA序列对Cripto-1基因沉默均有效，其中pSilencer2.1/Cripto-1 shRNA-413的沉默效果最为明显，WB检测的结果与FQ-PCR的一致。选择沉默效应最高的siRNA序列包装shRNA质粒载体，质粒浓度为1ug/uL。 成功转染pSilencer2.1/Cripto-1 shRNA-413至人食管癌Eca109细胞后，干扰组与对照组和空白组相比，经实时荧光定量PCR和WB检测N-cad，Vim的mRNA和蛋白表达均显著下调(P<0.01)；而E-cad的mRNA和蛋白表达水平高于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)，阴性对照组和空白对照组之间比较无显著性差异(P>0.05)。 通过靶向沉默Cripto-1表达及联合应用紫杉醇和顺铂作用于人食管癌细胞Eca109后，平板克隆形成实验检测细胞体外增殖情况的结果显示干扰组、药物组、干扰+药物组和空白对照组、阴性对照组细胞的增殖能力有显著性差异(P<0.01)。干扰+药物组细胞增殖能力下降最为显著，较干扰组和药物组细胞的增殖能力显著下降(P<0.01)。空白对照组、阴性对照组之间细胞的增殖能力无显著性差异(P>0.05)。 流式细胞术分别检测5组细胞的细胞周期分布和细胞凋亡率情况，结果同样显示干扰组，药物组，干扰+药物组细胞的S期比例显著减少，细胞凋亡率显著增加(P均<0.01)。干扰+药物组细胞较干扰组和药物组细胞的S期比例显著减少，细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。 Transwell细胞迁移实验结果显示相对于空白对照组、阴性对照组的细胞，干扰组、药物组、干扰+药物组穿过Transwell小室的细胞数显著下降，差异具有显著性(P<0.01)；干扰+药物组的细胞较干扰组和药物组穿过Transwell小室的细胞数显著减少，差异具有显著性(P<0.01)；空白对照组与阴性对照组、药物组与干扰组之间细胞凋亡率均无明显著性差异(P>0.05)。 结论： 本研究显示相对于癌旁及正常食管癌组织，Cripto-1在食管癌组织中表达上调；靶向沉默Cripto-1基因后显著抑制了人食管癌细胞Eca109的体外增殖、迁移和侵袭能力；Cripto-1在食管癌的侵袭转移过程中起着重要的作用。