【摘 要】
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该论文从建立蜗牛壳聚糖内切酶活性检测手段入手,研究了影响酶活性的一系列因素,同时对现有的实验方法进行了比较,确定了纯化的最佳条件,设计出一套可行的实验方案,对蜗牛酶
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该论文从建立蜗牛壳聚糖内切酶活性检测手段入手,研究了影响酶活性的一系列因素,同时对现有的实验方法进行了比较,确定了纯化的最佳条件,设计出一套可行的实验方案,对蜗牛酶进行了纯化,获得了以下结果:1.考察了蜗牛酶活性检测方法,最终选择对羟基苯甲酸酰肼(p-hydroxybenzonic acide hydrazidde,PAHBAH)还原糖测定方法作为酶活性的测定方法.2.为了选择酶蛋白纯化的方法,该实验比较了几种常用的蛋白质纯化方法:1)硫酸铵盐析可以处理大量蛋白质,但对目标酶蛋白纯化效果不佳.2)DEAE-Sepharose离子交换层析、凝胶过滤、疏水作用层析、羟基磷灰石层析对蜗牛酶均有较好的分离效果.羟基磷灰石层析结果显示目标酶是中性或酸性蛋白质.3.在对各种层析方法实际效果进行分析的基础上,设计出一套较为合理而有效的纯化蜗牛酶的方案.首选采用疏水作用层析,收集酶活性组分用DEAE-Sepharose 离子交换层析进行第二步分离,活性高组分经Sephacry1 S-300凝胶过滤分离,同时用电泳检测分离纯化的效果.SDS-PAGE上用银染的方法呈单一蛋白条带.比活性增高了33.333倍.纯化倍数为18.272.得率为0.15.4.根据SDE-PAGE测得壳聚糖酶的分子量为100KD,其等电点PI为5.45,米氏常数K m为0.154mmol/L,最大反应速度Vmax为0.305umol/L.h.产物聚合度较大.
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