前言：　　肿瘤已经成为威胁人类健康的重大疾病，侵袭和转移是肿瘤病人的主要死亡原因。大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，就诊时50％以上的患者已发生转移，预后较差，5年生存率只有6％。因此，发展针对转移性大肠癌的高效诊断和治疗方法对提高患者生存率具有重要意义。然而，目前缺乏有效的技术和方法发现并检测肿瘤转移相关分子标志物，制约了临床诊断、治疗的准确性和有效性。　　核酸适配子（aptamer）是一段短的寡核苷酸序列（ssDNA或RNA），是利用指数富集的系统进化技术(the systematic evolution of ligands by exponentialenrichment，SELEX)从包含各种寡核苷酸序列的文库中筛选得到。将随机寡核苷酸文库与靶分子孵育结合，经过多轮的筛选和扩增，得到能与靶分子高亲和力和特异性结合的寡核苷酸序列，即核酸适配子(aptamer)。核酸适配子可以折叠成特定的三维结构，通过空间构型互补与靶分子结合，与蛋白抗体相比具有以下优点:(1)亲和性和特异性更高;(2)作用的靶分子范围更广;(3)稳定性好，不易降解;(4)分子量小，组织渗透性强;(5)免疫原性和毒性低;(6)容易合成和易于修饰。因此，核酸适配子的筛选及其应用研究在生物医学领域得到了广泛的关注，为疾病的诊断和治疗研究提供一种全新的手段。　　在传统SELEX技术基础上，发展了以完整活细胞为靶标的筛选技术即Cell-SELEX技术。与以单一纯化靶蛋白为靶标的传统SELEX技术相比，Cell-SELEX技术具有的主要优势是:首先，筛选时以活体细胞为对象，使筛选所得的核酸适配子能够识别处于活性状态的生物分子;其次，可以在不需要了解细胞分子特征的情况下进行筛选;第三，一次筛选可获得多个识别不同靶分子的核酸适配子。近年通过在筛选过程中引入消减策略，即将具有差异生物学行为的细胞配对进行消减筛选，使筛选到的核酸适配子具有更高的特异性，可以分辨出细胞亚型之间的微小差异。基于Cell-SELEX技术的诸多优势，近年，众多研究者采用该技术获得肿瘤特异性核酸适配子，并应用于肿瘤标志物的发现、肿瘤细胞的靶向成像、循环肿瘤细胞的捕获富集以及药物的的靶向递送等。　　由Cell-SELEX技术筛选得到的核酸适配子可与细胞表面靶分子特异结合，其中能与细胞表面受体结合的核酸适配子可通过受体介导的内吞作用进入细胞，因而可以作为药物载体实现药物的靶向递送。目前化疗仍然是临床肿瘤治疗的主要手段之一，但存在的主要问题是缺乏靶向性和选择性，对正常组织/细胞具有较强的毒副作用，而且在化疗方案进行的过程中，绝大部分患者很快发生获得性耐药，产生治疗抵抗。而通过主动靶向递送系统将化疗药物释放至肿瘤组织/细胞，能够显著性地增加药物的功效并降低其毒副作用。相对普遍使用的主动靶向载体如蛋白类抗体，核酸适配子具有更好的体内应用优势，如分子量小、组织渗透性强、免疫原性低等。目前已有研究将其作为靶向载体将化疗药物、siRNA、底物酶等靶向输送至特定的器官、组织甚至细胞，有效提高了药物在靶组织/细胞的浓度，并降低毒副作用。　　核酸适配子容易修饰和标记的特点使其易于与各种纳米材料结合形成分子探针进行靶向成像。量子点(QD)是尺寸介于1-20nm之间，通常是由Ⅱ-Ⅵ族（如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等）或Ⅲ-Ⅴ族（如InP、InAs等）元素组成的一种半导体荧光纳米颗粒。与传统的有机染料相比，量子点具有激发光谱宽而连续、发射光谱窄而对称，量子产率较高，荧光寿命长，光稳定性好，抗光漂白能力强，发射光颜色与粒径大小关联等优点，已广泛的应用于化学生物传感与生物医学成像等领域，特别在肿瘤成像应用研究中，多种荧光量子点已被发展成为肿瘤标记物识别探针，实现了细胞以及活体层面肿瘤的特异性检测以及靶向成像。随着SELEX技术的不断进步，越来越多肿瘤特异性的核酸适配子被筛选出来，并作为肿瘤靶向分子与量子点结合形成荧光探针，在肿瘤细胞靶向成像、检测以及靶向治疗研究中得到了重要应用。　　在肿瘤转移的过程中，脱离原发肿瘤、侵袭并进入循环系统的肿瘤细胞被称为循环肿瘤细胞(CTCs)。许多研究表明，对外周血中的循环肿瘤细胞进行检测分析，有助于早期发现肿瘤的微转移、转移风险的预测和判断、评估化疗/放疗治疗效果、以及评估预后和监测复发等。循环肿瘤细胞在血液中数量极少（尤其是早期肿瘤），检测难度大，研究显示，利用核酸适配子与靶细胞的高特异性、高亲和力的结合特性，可实现对肿瘤患者循环肿瘤细胞的高效富集，用于进行肿瘤转移、复发及用药疗效的监测。　　为此，本研究采用消减Cell-SELEX技术，以转移性大肠癌细胞系LoVo为靶细胞，非转移性大肠癌细胞系HCT-8为消减细胞进行消减筛选，获得了一组7个与转移性大肠癌细胞特异性结合的核酸适配子。利用核酸适配子与靶细胞表面分子的不同结合特性，进行了不同的功能性应用:能够识别靶细胞表面受体的核酸适配子W14作为药物载体，实现了抗肿瘤药物阿霉素的靶向输送;具有最高亲和力的核酸适配子W3与量子点偶联形成分子探针，实现了对转移性肿瘤细胞/组织的靶向成像，同时还证实核酸适配子W3结合的靶分子与肿瘤的侵袭转移相关;采用核酸适配子W3建立了基于磁珠和基于微流控芯片的细胞捕获系统，实现了转移性肿瘤细胞的靶向捕获和富集，为转移性肿瘤的检测、诊断和治疗提供了新的方法和手段。　　材料与方法：　　一、转移性大肠癌特异性核酸适配子的筛选及鉴定　　1、构建随机寡核苷酸文库，对文库特性分析和PCR扩增条件进行优化。以转移性大肠癌细胞系LoVo为靶细胞，非转移性大肠癌细胞系HCT-8为消减细胞进行消减Cell-SELEX筛选，利用流式细胞术和荧光显微镜监测文库的富集程度。　　2、选取富集程度最高的文库进行测序，并对序列进行结构分析，选取候选适配子进行细胞结合鉴定，确定其特异性和亲和力，以及不同温度下的结合能力。　　3、探讨核酸适配子结合靶点的生化特性，分别使用胰蛋白酶和蛋白酶K处理细胞，流式细胞术检测处理前后细胞与核酸适配子的结合能力。　　4、将核酸适配子与不同组织来源的细胞系进行细胞选择性分析(SW620、HCT116、 HT29、 CX1、CloneA、 CL187、SGC-7901、BGC823、MDA-MB-231、MDA-MB-435、 MCF7、 H1229、 SMMC7721、U87MG、U251MG、HEK293、GES-1、CHO、NIH3T3等），流式细胞术检测核酸适配子与各细胞系的结合能力。　　二、核酸适配子W14-阿霉素(W14-Dox)靶向载药系统的建立　　1、流式细胞术和荧光显微镜观察分析核酸适配子W14结合受体并经受体介导进入靶细胞内。同时，利用琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术考察核酸适配子W14在含10％ FBS培养基和人新鲜血浆中的稳定性。　　2、制备W14-Dox复合物，荧光光谱分析并优化阿霉素嵌入DNA中的比例，利用流式细胞术分析W14-Dox复合物与靶细胞的结合能力。　　3、体外评估W14-Dox靶向体系的有效性，用W14、Dox和W14-Dox分别与靶细胞LoVo或非靶细胞HCT-8共孵育，利用荧光显微镜、流式细胞术检测不同形式Dox的细胞特异性摄取，MTS法检测不同形式的Dox的靶向杀伤活性。　　三、核酸适配子-量子点探针(W3-QD)对转移性肿瘤细胞的靶向成像及多靶点应用　　1、W3-QD探针分别与细胞系LoVo、SGC-7901、MDA-MB-231、HeLa、CL187、HEK293孵育，荧光显微镜下观察W3-QD探针对细胞系的靶向成像。　　2、皮下和尾静脉注射人胃癌高侵袭细胞系SGC-7901分别制备荷瘤模型和肺转移模型，取皮下移植瘤和肺组织转移瘤常规包埋制备石蜡切片。　　3、W3-QD探针分别与裸鼠模型石蜡切片和临床大肠癌病理切片孵育，考察其靶向成像的能力。　　4、流式细胞术分选W3阳性细胞亚群，并分析其生物学行为:采用MTS法分析细胞的体外增殖能力，软琼脂形成实验分析细胞的单克隆形成能力，划痕实验和Transwell细胞迁移实验分析细胞的体外迁移能力和Transwell细胞侵袭实验分析细胞的体外侵袭能力。　　5、利用流式细胞术和荧光显微镜观察分析各核酸适配子在结合靶细胞上是否存在相互干扰，同时利用各核酸适配子结合不同的靶分子的特性，对多靶点结合检测靶细胞进行了初步的考察。　　四、核酸适配子W3对转移性肿瘤细胞的靶向捕获富集　　1、制备功能性磁性(W3-beads)，并考察W3-beads对靶细胞的特异性捕获，同时探讨其对不同混合比例下靶细胞的捕获能力和捕获效率。　　2、将靶肿瘤细胞掺入全血中，流式细胞术检测核酸适配子W3对全血中肿瘤细胞的识别能力，并考察W3-beads对全血中肿瘤细胞的捕获能力。　　3、采用正光胶制备PDMS微流控芯片，并考察核酸适配子W3在芯片中捕获细胞的条件优化:核酸适配子W3的使用浓度和注入细胞时的流速。　　4、考察核酸适配子W3在芯片中对混合细胞中靶细胞的靶向捕获能力，以及不同混合细胞比例下的捕获能力。　　实验结果：　　一、转移性大肠癌特异性核酸适配子的筛选及鉴定　　本研究以转移性大肠癌细胞系LoVo为靶细胞，非转移性大肠癌细胞系HCT-8为消减细胞进行消减Cell-SELEX，成功获得7条能够与靶细胞LoVo高亲和力和特异性的核酸适配子（W1、W3、W6、W9、W14、W17和W22），其解离常数均在纳摩尔级别。在不同温度下（4℃、25℃和37℃）下，各核酸适配子均能与靶细胞高亲和力的结合。酶处理实验结果显示，W1和W3与靶细胞的结合未被蛋白酶的作用所破坏，推测结合的靶分子是膜表面的非蛋白分子;而其他核酸适配子（W6、W9、W14、W17和W22）可被蛋白酶消化而破坏，推测结合的靶分子是细胞膜表面蛋白;内吞实验结果显示，W6、W9和W14结合的靶分子是膜表面受体并可经受体介导进入靶细胞内。此外，细胞结合实验显示7个核酸适配子与正常细胞均不结合，而除了与靶细胞LoVo高亲和力结合之外，与其他转移性大肠癌或不同组织来源的转移性肿瘤细胞均有结合(SW620、HCT116、SGC7901、HeLa、C6等)，核酸适配子具有转移性肿瘤的结合特异性。　　二、核酸适配子W14-阿霉素(W14-Dox)靶向载药系统的建立　　受体结合的核酸适配子W14与Dox偶联作为药物载体，W14-Dox复合物的荧光检测结果提示，当W14与Dox的摩尔比为0.25时，Dox的自发荧光基本淬灭，提示一个核酸适配子W14分子中可以嵌入四个Dox分子形成复合物。细胞结合实验显示复合物保留了核酸适配子W14对靶细胞的特异性和亲和力，并能够被靶细胞选择性地摄入。MTS检测显示W14-Dox复合物能够特异性杀伤靶细胞，并降低了Dox对非靶细胞的杀伤作用。此外，核酸适配子W14在人新鲜血浆中未被降解并保持其与靶细胞的结合能力，具有很好的生物稳定性，提示核酸适配子W14可以作为体内靶向用药的载体。　　三、核酸适配子结合量子点(W3-QD)对转移性肿瘤细胞的靶向成像及多靶点应用　　应用制备的W3-QD探针分别探讨其对转移性肿瘤细胞系、荷瘤裸鼠肿瘤组织以及大肠癌患者肿瘤组织的靶向成像能力。荧光显微镜成像显示，W3-QD探针不仅能够实现对转移性肿瘤细胞系的靶向成像，还能对荷瘤裸鼠模型和转移模型以及临床大肠癌病理标本的肿瘤组织靶向成像。对89例的临床大肠癌标本进行荧光信号的采集以及统计学分析，结果显示W3-QD的荧光强度与淋巴结转移与否高度相关，表现为转移性肿瘤组织的荧光信号高于非转移性肿瘤组织，提示核酸适配子W3结合的靶细胞表面分子可能为肿瘤转移相关分子标志物。基于此推测，采用流式分选技术对靶细胞LoVo进行了基于W3结合特异性的分选，收集得到LoVo W3+细胞亚群和LoVo W3-细胞亚群。两个亚群细胞的生物学行为分析显示LoVo W3+细胞亚群的体外增殖能力和单克隆形成能力与LoVo W3-细胞亚群相似，但是体外的迁移和侵袭能力显著高于LoVo W3-细胞亚群，进一步说明核酸适配子W3结合的靶分子与肿瘤的侵袭转移有关。核酸适配子的竞争实验结果显示，7个核酸适配子结合的细胞表面靶分子都是不同的，联合使用对肿瘤细胞进行多靶点检测时，可以提高检测的灵敏度和检出率。　　四、核酸适配子W3对转移性肿瘤细胞的靶向捕获富集　　将核酸适配子W3结合磁珠(W3-beads)建立细胞捕获系统，分析结果显示，W3-beads能够特异性的捕获靶细胞，在不同比例的靶细胞/非靶细胞混合液中均能对靶细胞进行靶向捕获。即使在靶细胞只占1％的低比例下，捕获细胞仍能保持较高的纯度。将靶细胞掺入全血中，W3-beads能够保持其与靶细胞的结合力并能对靶细胞进行特异性的捕获富集。　　将核酸适配子W3固定于微流控芯片通道中建立基于微流控芯片的细胞捕获系统，通过对核酸适配子W3的使用浓度和细胞注入时的流速进行优化，核酸适配子W3能够在芯片通道内特异性的捕获靶细胞，在不同混合比例的细胞中也能保持对靶细胞的靶向捕获，这为下一步对临床肿瘤病人血液中循环肿瘤细胞的收集及检测提供了很好的实验基础。　　结论：　　1、通过消减Cell-SELEX技术，成功获得了7个针对转移性大肠癌LoVo细胞的高亲和性核酸适配子;这些核酸适配子均不与正常细胞结合，与具有侵袭转移倾向的不同组织来源的肿瘤细胞特异性结合，表现为肿瘤细胞的转移特异性。　　2、以核酸适配子W14作为药物载体，构建W14-Dox靶向释药系统，成功实现了对转移性大肠癌细胞LoVo的靶向杀伤作用，明显降低了对非靶细胞的细胞毒性。　　3、以核酸适配子W3制备量子点探针（W3-QD），实现对转移性肿瘤细胞系、荷瘤裸鼠肿瘤组织和临床大肠癌病理组织的靶向成像，并证实核酸适配子W3结合的靶分子与肿瘤的侵袭转移相关;筛选得到的7个核酸适配子对靶细胞的识别无相互干扰，联合应用明显提高成像灵敏度。　　4、采用建立的磁珠及微流控芯片细胞捕获系统成功实现对混合细胞及人全血中靶细胞的靶向捕获和富集，为高效捕获富集循环肿瘤细胞提供有效的新方法。