目的皮肤是身体最大的器官,起到保护机体的屏障作用。临床上大面积烧伤或严重外伤造成的急性全层皮肤缺损非常常见,但长期以来缺乏理想的治疗措施。有研究表明,超过4cm的全层皮肤缺损一般无法自行愈合,需通过皮片移植来修复。断层皮片移植是修复深层皮肤损伤的金标准,但有限的自体皮源或受区并发症限制了它的广泛应用。异体皮或异种皮可以暂时覆盖创面,但可能带来免疫排斥和疾病传播的风险。干细胞研究与发现使创面的理想修复成为可能。有研究表明,骨髓间充质干细胞(BMSCs)能有效促进缺血组织的血流灌注,从而促进创伤组织愈合。间充质干细胞(MSCs)属于基质细胞,具有很强的自我更新能力及多向分化潜能,被认为是非常有前景的组织再生修复的细胞来源。过去采集骨髓并制成单细胞悬液进行多点注射,步骤复杂,操作过程中可能混杂有T淋巴细胞或肿瘤细胞,因此有肿瘤和严重的移植物抗宿主疾病形成的风险。正常情况下,MSCs位于骨髓及其他器官的基质、皮下脂肪组织和肌肉组织中,血液循环中数量较少,身体遭遇创伤或缺血时,血液中MSCs数量会相应增加,但是如何在局部创面安全、定向聚集MSC仍然是一个尚待解决的问题。在本研究中,拟将MSC亲和肽(E7)绑定于胶原支架上,制成CBD-E7复合体,用于猪皮肤创面模型。胶原绑定干细胞活性物质的方法免去了采集骨髓和分离干细胞的操作,通过一次操作同时获取了种子细胞和生物支架；同时由于抗原抗体反应在自身免疫系统的监视下进行,也减少了肿瘤发生的风险。该复合体能够使血液、肌肉和骨髓基质中的MSC细胞在创面周围定向聚集,从而充分发挥其在局部创面的多向分化和旁分泌作用,促进皮肤创面的愈合。本实验旨在研究其在创面愈合中的机制,探讨如何更好、更安全、更有效地利用自体间充质干细胞。材料与方法材料：从鼠尾肌腱中提取Ⅰ型胶原蛋白,使用冻干技术将其制成多孔疏松的胶原膜片,裁剪成大小5.0cm×5.0cm,厚度1.0mm备用。将CBD-E7亲和肽,采用Fmoc方法加载到胶原膜片上,制成CBD-E7胶原膜片。扫描电镜观察胶原膜片形态、三维结构及孔隙大小。实验方法体外实验于实验猪股动脉抽取100m1新鲜外周血,平均置于2个无菌培养皿中。空白胶原膜片与CBD-E7胶原膜片分别用5%胎牛血清(BSA)封闭后,加入到各培养皿中,置于37℃恒温摇床缓慢摇动60min。PBS漂洗3遍,将各组膜片剪成0.1cm2微粒状,加入1%Ⅰ型胶原酶消化后离心,取细胞沉淀。另取50ml新鲜外周血,红细胞裂解液裂解红细胞后,离心取细胞沉淀。流式细胞仪观察细胞表型及细胞比例。将空白胶原膜片、CBD-E7胶原膜片消化后得到的细胞及外周血裂红后得到的细胞,经计数后,取1×106细胞数,分别用400m PBS重悬,每组各取4只流式细胞管,各组分别标记为CD45,CD29/CD45,CD44/CD45, CD29/CD44/CD45,各管中分别加入细胞悬液及对应的细胞抗体,暗箱孵育30min后上流式细胞仪观察CD45阴性细胞中,CD44、CD29双阳性的比例。体内试验1.5只雌性实验用猪,体重在20-25 kg之间,适应性饲养3天后,实验分组,每只猪背部设计6个5×5cm大小的急性皮肤全层缺损创面,5只猪共30个创面。其中2只实验猪共12个创面,用于观察胶原膜片细胞渗透情况,随机分为2组：胶原膜片组(膜片组,n=3x2)：创面局部应用空白膜片；CBD-MSC亲和肽(E7)组(CBD-E7组,n=3x2)：创面局部覆盖绑定MSC亲和肽(E7)的胶原膜片；另外3只实验猪共18个创面,用于观察各组胶原膜片对创面愈合时间及愈合质量的影响,随机分为3组：空白对照组(对照组,n=3×2)：创面局部喷洒PBS；胶原膜片组(膜片组,n=3×2)：创面局部应用空白膜片；CBD-MSC亲和肽(E7)组(CBD-E7组,n=3×2)：创面局部覆盖绑定MSC亲和肽(E7)的胶原膜片。2.制备动物模型,沿脊柱旁开2cm切开皮肤至深筋膜层,制备6个5×5cm大小的急性皮肤全层缺损创面,将各组膜片PBS浸润,覆盖于创面局部,1-0丝线固定于创缘皮肤,创面予无菌敷料加压包扎,术后隔日换药,分笼饲养,术后连续3天青霉素肌注防止感染；3.术后第3d处死2只用于观察膜片渗透情况的实验动物,取创面及胶原膜片观察细胞渗透情况,切取1.0×1.0cm膜片,荧光染料Hoechst 33342 (2 mg/ml, Sigma)染色15 min,荧光显微镜下观察细胞分布；4.另外3只用于体内实验的动物,于术后第7d、14d、21d,28d各组拍照,并计算创面愈合率；5.取7d、28d、112d创面肉芽组织,行HE染色、免疫组化及天狼猩红染色。术后7d取创面肉芽组织,甲醛固定,作病理切片,行HE染色,观察局部创面肉芽组织炎症反应；行免疫组化观察肉芽创面新生血管情况,术后28d天行HE染色,观察胶原纤维排列情况；术后112d取局部瘢痕组织行狼猩红染色分析新生胶原形成情况及Ⅰ、Ⅲ型胶原比例。结果体外实验1.扫描电镜显示：该胶原膜片具有疏松的三维空间立体结构,孔隙范围在20μm至2001m之间；2.术后3d膜片Hoechst 33342荧光染色显示,CBD-E7组有更多的细胞浸润；3.术后3d流式细胞仪检测各组细胞CD45,CD44,CD29表达情况,CBD-E7组中干细胞比例(CD45-中CD29+、CD44+的比例)为：98.5%±6.5,远高于膜片组：76.3%±1.3及外周血。外周血中红细胞裂解后该比例为63.5%±2.9。三组数据有统计学差异(P<0.05)体内实验1.术后7d HE染色观察结果,与对照组、膜片组相比,CBD-E7组创面肉芽组织切片有更多新生血管生成；2. CBD-E7组创面愈合率在第7d,14d,21d,28d分别为3.96±1.9%,86.93±±3.1%,92.05±±1.6%,96.90±2.3%,第7d时各组创面愈合率比较无统计学差异(P>0.05),第14d,21d,28d,与膜片组,对照组相比,CBD-E7组显示出更高的创面愈合率(P<0.05或P<0.01)；3.术后7d创面肉芽组织及胶原膜片病理切片示,每高倍视野中,CBD-E7组细胞数400±8.8,远高于空白膜片组124±9.9,有显著差异(P<0.01)；4.组织学观察结果4.1免疫组化染色结果,与对照组,膜片组相比,CBD-E7组切片表现出更多的血管数目(对照组：37.30±6.73,膜片组：58.35±5.03,CBD-E7组：78.70±8.77,P<0.01)；4.2术后28d及112d,HE染色示：CBD-E7组新生胶原纤细,排列整齐,平行排列于真皮层,呈规律的波纹状,膜片组及对照组胶原排列致密,形态不规则；4.3术后112d切片行天狼猩红染色,偏振光显微镜下观察Ⅰ、Ⅲ型胶原比例,CBD-E7组Ⅲ型胶原比例为34%,膜片组为19%,对照组为12%,CBD-E7组Ⅲ型胶原含量较另外两组高。4.4术后112d取创面瘢痕组织,行HE染色,观察皮肤附属器(如毛囊、汗腺、皮脂腺等)生长情况。结论1.CBD-E7胶原膜片能够有效地富集血液中的间充质干细胞,从而发挥持久靶向治疗作用；2.CBD-E7胶原膜片能够增加创面局部新生毛细血管数量,从而促进创面愈合；3.CBD-E7胶原膜片能提高局部创面Ⅲ型胶原比例,使瘢痕柔软,提高创面愈合质量。4.CBD-E7胶原膜片能够促进皮肤附属器生长,提高创面愈合质量。