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肺癌是目前全世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的主要组织学类型,占全部肺癌的85%左右。大多数肺癌患者被发现时已处于晚期,预后较差。近年来,以表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI)吉非替尼(Gefitinib)为代表的分子靶向药物取代传统的细胞毒性药物,在晚期NSCLC EGFR敏感突变(主要包括19外显子缺失突变、21外显子L858R点突变)患者的治疗中获得巨大成功。然而,经过一段时间的治疗(中位时间8-12个月)大多数患者会对EGFR-TKI产生获得性耐药,因而限制了其临床应用和疗效,成为晚期NSCLC靶向治疗亟待解决的关键问题之一。许多研究证实EGFR-TKI耐药与EGFR二次突变、旁路激活、表型转换等有关。针对已发现的耐药机制,EGFR-TKI已在不断更新换代,而且临床上也在发展各种联合化疗方案,但效果仍不尽人意。因此,探寻新的耐药机制仍任重道远。CA916798基因是本课题组在既往研究中首先发现、报告并证实的与肺癌顺铂耐药相关的新基因,其可能通过PI3K/AKT通路参与顺铂耐药,且耐药机制与抗凋亡有关。IPASS研究亚组分析发现EGFR突变和未突变患者其化疗客观缓解率存在显著差异,提示化疗耐药和靶向耐药可能存在某种联系。但CA916798基因在EGFR-TKIs耐药中的作用及其分子机制至今尚无报道。因此,我们推论促进顺铂耐药的CA16798也可能在非小细胞肺癌细胞的EGFR-TKI靶向药物的耐药中发挥重要作用。本研究拟经一系列体内外实验证实这一假设并初步探讨其可能的分子机制。本研究的主要方法、结果及结论如下:1.CA916798促进NSCLC细胞对EGFR-TKI的耐药作用(1)CA916798在EGFR-TKI获得性耐药NSCLC细胞中高表达通过间歇诱导法我们诱导了两株EGFR-TKI获得性耐药株PC9/GR(吉非替尼耐药株)和HCC827/IR(埃克替尼耐药株)。qRT-PCR和Western Blot检测显示,两株EGFR-TKI耐药株中CA916798的mRNA和蛋白表达水平都显著高于亲本细胞(p<0.01)。提示CA916798可能在NSCLC细胞对EGFR-TKI获得性耐药中发挥作用。(2)沉默/过表达CA916798显著改变NSCLC细胞对EGFR-TKI的敏感性为了探究CA916798在NSCLC EGRF-TKI获得性耐药中的作用,我们使用shRNA构建了稳定沉默CA916798表达的PC9/GR和HCC827/IR以及稳定过表达CA916798的PC9和HCC827细胞模型。结果发现,敲低CA916798的表达后,耐药细胞PC9/GR和HCC827/IR对EGFR-TKIs的敏感性显著提高(p<0.01);相反,稳定过表达CA916798(over-CA916798)显著降低了敏感细胞PC9和HCC827对EGFR-TKI的敏感性。这些结果表明CA916798是促进NSCLC细胞EGFR-TKI获得性耐药的重要分子。2.敲低CA916798可减弱NSCLC耐药细胞来源的体内移植瘤的生长并提高移植瘤对TKIs的敏感性为了进一步验证CA916798在NSCLC细胞EGFR-TKIs获得性耐药中的作用,我们进行了小鼠体内实验。我们将稳定敲低CA916798的吉非替尼耐药细胞株PC9/GR-shCA916798及其对照细胞,通过皮下注射在NOD/SCID小鼠中建立移植瘤模型,并给予吉非替尼/安慰剂治疗,观察对移植瘤生长的影响。实验结果显示,敲低CA916798后,吉非替尼耐药细胞株在小鼠体内所形成的移植瘤的生长受到显著抑制(p<0.05)。结果还显示,吉非替尼治疗在敲低组显示出更好的疗效,即敲低CA916798并联合吉非替尼治疗组小鼠移植瘤的体积和重量显著小于对照组(p<0.001)。3.CA916798消弱EGFR-TKI诱导NSCLC细胞凋亡的作用我们从细胞凋亡方面研究了CA916798对EGFR-TKIs获得性耐药的影响。通过Annexin V-APC/PI双染法检测敲低或过表达CA916798后细胞在EGFR-TKI药物处理后的细胞凋亡率。实验结果显示,敲低CA196798后可显著提高耐药细胞在EGFR-TKI药物作用下的凋亡率(p<0.001);相反在敏感细胞中过表达CA196798可显著降低细胞在EGFR-TKI药物诱导下的细胞凋亡率(p<0.001)。这些实验结果提示,CA916798可能是通过影响细胞凋亡作用从而影响细胞对EGFR-TKI的敏感性。4.HMGA2可能是介导CA916798促进EGFR-TKI耐药的关键分子为了探究CA916798促进EGFR-TKIs耐药的机制,我们进行了转录组测序(RNA-Seq),比较敲低CA916798的PC9/GR细胞与对照细胞基因表达谱的差异。结果显示,敲低CA916798后,HMGA2分子显著下调,并经qRT-PCR实验获得验证;qRT-PCR和Western Blot实验分析表明,HMAG2与CA916798分子的表达正相关。提示HMGA2可能是CA916798促进EGFR-TKIs耐药的关键分子。5.CA916798可能通过HMGA2调节Bcl-2/Bax的表达而抑制NSCLC细胞的凋亡为了进一步探讨CA916798促进NSCLC细胞抗凋亡的分子机制,我们通过Western Blot对细胞凋亡关键分子BCL-2家族相关分子进行筛选,结果发现耐药细胞株敲低C916798后,HMGA2表达下降,促凋亡蛋白BAX表达上升,抗凋亡蛋白BCL-2表达下降;相反,在敏感细胞株中过表达CA916798,HMGA2表达上升,促凋亡BAX表达下降,抗凋亡蛋白BCL-2的表达上升。这些结果表明,CA916798可能是通过HMGA2调节Bcl-2/Bax的表达抑制NSCLC细胞的凋亡进而促进了其对EGFR-TKIs耐药。结论:1.EGFR-TKI获得性耐药NSCLC细胞高表达CA196798;2.CA916798通过抑制EGFR-TKI诱导NSCLC细胞凋亡的作用,从而促进NSCLC细胞对EGFR-TKI耐药。3.CA916798可能通过HMGA2调节Bcl-2/Bax的表达,而抑制EGFR-TKI诱导的NSCLC细胞凋亡。