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目的分别构建大鼠pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF真核表达质粒，并检测其在cos-7细胞中的共表达，为下一步进行基因治疗脊髓损伤提供实验基础。方法①pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF真核表达载体的构建及鉴定：3周龄SD大鼠一只脱颈处死后，在无菌、无RNA酶污染、冰冷的条件下利用Trizol试剂提取出大鼠颌下腺及坐骨神经组织总RNA。利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分别扩增出EGF及CNTF基因功能片段，电泳分析结束后回收纯化PCR产物，回收产物分别与空白质粒pSecTag2/Hygro B同时进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切，两组酶切产物经T4DNA连接酶作用后，分别转化入感受态大肠杆菌JM109，LB琼脂平板培养过夜。经PCR初筛，两组阳性克隆分别行BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果使用BLAST软件与GeneBank数据库进行同源性分析。②cos-7细胞的转染和重组大鼠EGF、CNTF蛋白的表达及检测：取纯化的重组质粒pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF，在脂质体试剂LipofectamineTM2000的作用下分别单独及共转染cos-7细胞。转染48h后分别收集三组细胞培养液，Western blot鉴定重组EGF、CNTF蛋白在cos-7细胞各组中的表达情况。结果①逆转录聚合酶链反应成功获得大鼠EGF及CNTF cDNA功能片段。随机挑选两组各10个重组真核表达载体的克隆，聚合酶链反应筛选出两组阳性克隆各2个，经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组质粒构建成功。②两种质粒在脂质体介导下分别单独及共转染转染cos-7细胞48h后，Western blot鉴定重组EGF、CNTF蛋白在三组cos-7细胞中的表达，分别在6kDa和22kDa处出现阳性条带。结论大鼠EGF、CNTF基因的真核表达载体pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF构建成功。共转染cos-7细胞后能够共表达重组EGF、CNTF蛋白。