【摘 要】
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猫传染性鼻气管炎（Feline viral rhinotracheitis,FVR）是由猫疱疹病毒1型（Feline herpesvirus-1,FHV-1）所引起的一种常见的猫科动物上呼吸道传染病。长期以来,由于FHV-1的基因组庞大,核苷酸长度约为135kb,可编码约74种蛋白质,通过同源重组的传统方法来获得FHV-1的突变株十分困难,不利于对其目的基因进行缺失或突变等操作。本研究拟将FHV-
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猫传染性鼻气管炎（Feline viral rhinotracheitis,FVR）是由猫疱疹病毒1型（Feline herpesvirus-1,FHV-1）所引起的一种常见的猫科动物上呼吸道传染病。长期以来,由于FHV-1的基因组庞大,核苷酸长度约为135kb,可编码约74种蛋白质,通过同源重组的传统方法来获得FHV-1的突变株十分困难,不利于对其目的基因进行缺失或突变等操作。本研究拟将FHV-1长春市分离的CH-B株全基因组构建为感染性细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）,建立FHV-1 CH-B株反向遗传学系统,以便借助大肠杆菌质粒来对FHV-1 CH-B株全基因组进行修饰,提高构建重组病毒的效率,为进一步研究其基因功能和新型疫苗奠定基础。本研究根据FHV-1 CH-B株的US2区两侧的部分基因序列扩增出含有Loxp位点的上游同源臂US2-A和下游同源臂US2-B,将获取的US2-A和US2-B以及绿色荧光标记基因CMV-EGFP依次定向克隆至p UC119载体,构建了中间转移载体p UC119-A-Loxp-EGFP-B。将p Belo BAC11载体与p UC119-A-Loxp-EGFP-B分别经Sph I酶切后连接,构建了重组病毒转移载体p UC119-A-Loxp-EGFP-BAC-Loxp-B。将FHV-1CH-B株与重组病毒转移载体共转染F81细胞,经过4轮噬斑筛选得到了纯化的带有外源基因EGFP-BAC的重组猫疱疹病毒r-FHV-1-BAC。r-FHV-1-BAC在F81细胞上盲传15代后,CMV-EGFP依然正常表达,经过PCR鉴定在FHV-1 US2区插入的外源大基因片段和FHV-1的部分必需基因,结果表明重组病毒r-FHV-1-BAC得到了纯化且遗传稳定。将r-FHV-1-BAC感染F81细胞,在合适时机提取r-FHV-1-BAC的环化基因组,并立即进行电转化到DH10B感受态细胞中,以获得FHV-1 CH-B株BAC转化子。通过对亲本病毒FHV-1 CH-B株和纯化的重组病毒r-FHV-1-BAC的体外培养特性研究,发现r-FHV-1-BAC的增殖速度比FHV-1 CH-B株稍慢,隐蔽期延长,但两株病毒的噬斑形态和大小相似。以上结果证明,FHV-1 US2基因的缺失以及在此处外源大基因片段EGFP-BAC的插入降低了FHV-1 CH-B株在F81细胞上的复制增殖能力。纯化出的r-FHV-1-BAC为构建FHV-1 CH-B株细菌人工染色体系统提供材料,为今后获得FHV-1 CH-B株基因缺失疫苗提供了有力的条件,为FHV-1 CH-B株反向遗传操作技术平台的建立奠定基础。
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