研究背景结节性硬化综合征(TSC)是一种罕见的多系统常染色体显性遗传疾病,其特征是多器官存在良性先天性肿瘤。血管周围上皮样细胞分化的肿瘤,包括血管平滑肌脂肪瘤(AML)和淋巴管平滑肌瘤病(LAM)。TSC是由于机体TSC-1(编码错构素蛋白)或TSC-2(编码马铃薯蛋白)基因突变,导致其编码蛋白的表达发生异常,从而激活了下游的雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTOR1)通路,导致信号通路的异常,最终导致细胞的增殖、迁移等生物学功能变化。TSC是一种多系统全身性疾病,可累及心、肺、脑、肾脏、皮肤等多个器官,最终导致多器官功能衰竭而死亡。发生在肺的TSC为肺淋巴管平滑肌瘤病。肺淋巴管平滑肌瘤病(lymphangioleiomyomatosis,LAM),女性患者肺囊性病变的发生率约为26%-38%。LAM好发于育龄期妇女或绝经前妇女,其特点是气道、血管和淋巴管周围的非典型肌细胞(LAM细胞)增殖。LAM可能是散发性的(S-LAM)或与结节性硬化综合征(TSC-LAM)相关,疾病进展可导致血管和气道阻塞,囊肿形成和肺破坏。LAM的主要临床表现包括进行性呼吸困难、气胸、乳糜胸、腹部肿瘤,如血管平滑肌脂肪瘤和淋巴管平滑肌瘤,偶有咯血。LAM细胞在组织学上具有平滑肌特征,可以呈现TSC1或TSC2基因突变。研究发现,LAM发病的关键在于TSC2基因突变导致mTOR1通路的异常激活,雷帕霉素(Rpamycin)作为mTOR1的靶向抑制剂被批准用于LAM患者的治疗,通过治疗LAM患者的呼吸困难、气胸、咯血等不适症状可明显改善。但是停药后,LAM患者的肺功能继续恶化。因此,我们需要进一步探索LAM的发病机制,寻找更多的治疗方法。LAM的详细发病机制尚不完全清楚,胰岛素样生长因子与肿瘤细胞的增殖、转移和凋亡密切相关。胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)是血清中含量最高的IGF结合蛋白,它在循环中结合胰岛素、IGF-Ⅰ和Ⅱ,参与VEGF,NF-κB等通路的激活,从而调节肿瘤细胞的存活、分化、迁移和侵袭。最近的研究证实了 IGFBPs在包括直肠、卵巢、胰腺等实体肿瘤的诊断和预后预测中的作用。尽管IGFBP3在肿瘤发生中的起着重要的作用,但IGFBP3在LAM和其他激素依赖性肿瘤中的机制尚不清楚。因此,IGFBP3有望成为癌症治疗潜在的靶点之一。研究目的该课题的目的是进一步探究LAM疾病的发生转移机制,探究雷帕霉素介导IGFBP3在LAM疾病中的发病机制,来寻找新的治疗靶点,为LAM的临床治疗提供新的方向。LAM组织与正常肺组织相比,IGFBP3和P-S6在LAM组织中高表达,经西罗莫司(雷帕霉素类似物)治疗后,IGFBP3和P-S6表达降低。提示雷帕霉素通过靶向抑制mTOR1通路调控IGFBP3和P-S6来控制LAM疾病的发生转移机制。筛选并鉴定潜在的有效治疗靶点。但是西罗莫司治疗存在许多副作用,而且不能根治疾病,停药后疾病恶化,进展,研究发现IGFBP3参与调控多种肿瘤细胞的生长、发育和凋亡。探究IGFBP3介导LAM疾病的生长转移机制有重要意义。LAM发病机的制是因为TSC2基因的突变,成功构建病人第一代 LAM 细胞(621-101 TSC2-和 621-103 TSC2+细胞),以病人 621-101(TSC2-)细胞为主要研究对象,分别在是否有血清两种条件下探究雷帕霉素调控LAM的发病机制,以及IGFBP3在该疾病中扮演的角色;沉默IGFBP3基因表达后,评价IGFBP3对病人LAM细胞增殖,迁移和转移等生物学功能的影响。第一部分 正常肺组织和LAM组织中IGFBP3和P-S6的表达与临床病理学意义方法HE染色镜下观察LAM组织和正常肺组织的病理变化情况,免疫组织化学法检测LAM组织中IGFBP3和P-S6的表达,用西罗莫司(雷帕霉素类似物)治疗后LAM组织中蛋白的表达变化情况。结果1.免疫组化提示:根据LAM的特异性标记蛋白smooth muscle actin(+)和Phospho-S6(+)表达来确定LAM的诊断。由于mTOR通路激活可看到Phospho-S6阳性细胞簇,经过西罗莫司治疗后的,mTOR通路被抑制,Phospho-S6 呈阴性。2.之前有研究发现,IGFBP2在LAM患者中高表达,本次研究的患者病理组织中,我们发现再次验证了之前的IGFBP2在LAM组织中表达呈阳性,研究发现IGFBP3在这两例患者中呈阳性表达。小结LAM组织中IGFBP3和P-S6表达呈阳性,且经过西罗莫司治疗后P-S6成阴性,由于IGFBP3的表达与LAM患者肺功能存在着负相关,IGFBP3可能会成为预测LAM患者预后的一个重要的生物学指标。第二部分 雷帕霉素调控人LAM细胞621-101和621-103细胞中IGFBP3和P-S6的表达方法1.应用CCK8法检测621-101和621-103细胞分别在含有10%FBS培养基和不含血清的培养基的两种情况下的生长情况。2.检测621-101和621-103细胞分别在含有10%FBS培养基和不含血清的培养基的两种情况下用经典的碘化丙啶染色法(Propidium staining,即PI staining)测细胞周期。3.Western blot法检测621-101和621-103细胞上清中分泌蛋白的表达。4.Western blot检测在雷帕霉素的影响下621-101和621-103细胞内表达的变化,并且与无血清培养基培养进行对比。5.用PT-PCR检测在雷帕霉素的影响621-101和621-103细胞内IGFBP3基因表达的情况,并且与无血清培养基培养进行对比。6.统计学处理:所有数据均采用Graph Pad Prism 8.0软件进行数据的相关分析和统计,计量资料数据以x±s表示,采用独立样本t检验统计确定两组均数之间的差异;以α=0.05为显著性检验水准。结果1.WB:TSC2-细胞分泌的IGFBP3明显多于TSC2+细胞。2.WB结果显示:雷帕霉素显著抑制621-101和621-103细胞中P-S6蛋白的表达,与无血清培养基培养的细胞相比得出的结论一致。但是,雷帕霉素对621-101细胞中的IGFBP3抑制强于621-103细胞。3.RT-PCR结果显示:621-101细胞中,用含有10%FBS的完全培养基培养细胞,621-101细胞中雷帕霉素对IGFBP3 mRNA表达的抑制强于无血清培养的细胞(P<0.05)。621-103细胞在是否含有血清培养细胞的两种条件下雷帕霉素对IGFBP3基因表达的影响无明显差别。小结1.在人LAM细胞中IGFBP3高表达,雷帕霉素可以抑制621-101中IGFBP3的表达,且在营养充足的条件下抑制效果更为显著,作为mTOR通路的抑制剂,可能参与IGFBP3的调控,抑制了 IGFBP3的表达。2.在人LAM细胞中P-S6高表达,雷帕霉素作为mTOR通路的抑制剂可以抑制 621-101 和 621-103 中 Phospho-S6 表达。第三部分 沉默IGFBP3基因的表达对TSC2-细胞生物学功能的影响方法1.转染621-101细胞,得到沉默IGFBP3基因表达的细胞,用WB检测转染效率。2.转染成功以后,用cck-8(绘制生长曲线)检测细胞的生长情况。3.转染成功以后,Transwell法检测细胞的迁移和侵袭能力的变化。4.统计学分析:所有数据均采用Graph Pad Prism 8.0软件进行数据的相关分析和统计,采用独立样本t检验统计确定两组均数之间的差异;以α=0.05为显著性检验水准。结果1.通过WB验证证实细胞转染成功。2.与对照组比,沉默IGFBP3表达能抑制病人LAM细胞的增殖(P<0.05)。3.与对照组相比,Transwell法检测沉默IGFBP3表达后细胞的迁移和侵袭能力的减弱(P<0.05)。小结沉默IGFBP3表达后细胞的增殖、迁移和侵袭能力减弱,表达IGFBP3的能力减弱,表明IGFBP3参与LAM疾病的发生和发展,用mTOR通路抑制剂雷帕霉素可以抑制其增值和蛋白表达能力,表明雷帕霉素通过靶向抑制mTOR通路来调控IGFBP3的表达。结论1.本研究发现,LAM组织中IGFBP3和P-S6高表达,雷帕霉素可以抑制IGFBP3和P-S6的表达。2.mTOR1通路靶向抑制剂雷帕霉素能够抑制621-101细胞中IGFBP3和P-S6的表达,沉默IGFBP3的表达能抑制细胞的增值、侵袭和迁移能力,提示IGFBP3是mTOR通路中引起LAM疾病的重要蛋白,雷帕霉素通过抑制IGFBP3的表达来抑制LAM疾病的进展。