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EHEC O157:H7是肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli,EHEC)的一典型菌株,可引起人的出血性结肠炎(Hemorrhagic Colitis,HC),引发溶血性尿毒综合征(Haemolytic Uraemic Syndrome,HUS)及血栓性血小板减少紫癜(thromboticthrombocytopenic purpura,TTP)等并发症。
志贺毒素(Shiga Toxin,Stx)是一种能够确定EHEC特性的主要毒力因子,在肠道中Stx能够杀伤上皮细胞,并引起严重炎症反应和广泛性的组织学损伤,从而导致血痢或无血性腹泻。能够引起HC、HUS等症状甚至人的死亡。EHEC产生的Stx可以分为Stx1和Stx2。编码Stx1的序列高度保守,尚未发现变异型,但Stx2却有较多的变异型。研究表明,只表达Stx2菌株比只表达Stx1菌株甚至比同时表达Stx1和Stx2的菌株更能引起HUS的发生。还有人用体外培养的肾内皮细胞和小鼠做实验,证明Stx2比Stx1有更强烈的细胞毒作用。
本研究设计构建了大肠杆菌O157:H7的stx2基因缺失突变菌株021210(NalR),并建立小鼠动物模型对其特性进行了一系列的研究。首先,将O157:H7广州分离株021210诱导出具有萘啶酮酸抗性的突变株021210(NalR)。然后用PCR扩增出stx2基因,克隆到pMD18-T载体中,用单酶切的方法构建缺失了251 bp的stx2基因,再将其克隆到pKNG101自杀载体中,构建重组质粒pKNG101:△stx2,转化到宿主菌cc118感受态细胞,再将该质粒转导到021210(NalR)中,利用自杀性载体技术(suicide vector technique),根据同源重组的原理,敲除了基因组中的stx2基因,构建了021210(△stx2)基因缺失突变株。
为了评价021210(△stx2)缺失突变株的致病性,本研究设计了O157:H7的小鼠动物模型。选用20日龄离乳昆明鼠,先以萘啶酮酸处理,提高小鼠对肠出血性大肠杆菌O157的敏感性,再分别以不同剂量腹腔注射肠出血性大肠杆菌O157:H7021210(NalR)株,进行临床和病理学检查。并测定出021210(NalR)对小鼠的半数致死量。将构建的021210(△stx2)缺失突变株腹腔注射20日龄昆明鼠,饮水中加入萘啶酮酸。前三天体重小幅波动后,生长正常,没有出现明显临床症状,10日后剖检后肝脏、肺脏、肾脏、肠无病变,病理切片也无明显变化。021210(△stx2)缺失突变株培养上清液也不能对Veto细胞产生致细胞病变作用。结果证实所构建的EHEC0157:H7△stx2缺失突变菌株不能引起细胞病变,并丧失了对小鼠动物模型的致病性,该缺失突变菌株为进一步研究出预防EHEC0157感染的基因工程弱毒菌苗打下了基础。