iPLA2β在心脏缺血再灌注损伤中的作用及机制的研究

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冠状动脉粥样硬化性心脏病,由于冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变,导致血管管腔狭窄或阻塞,最终造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病。世界卫生组织官方网站2017年发布的重要事实显示心血管疾病是全球的首要死因。2016年,估计有1700多万人死于心血管疾病,占全球死亡总数的31%,其中,85%死于心脏病和中风,且缺血性心脏病首当其冲。尽管目前PCI技术的普及和不断发展进步,有效地减少了心梗面积,改善了临床预后,但却不能减少心肌梗死病人的死亡率,后来研究人员发现尽管开通了梗死的相关血管,但由其供血的梗死心肌面积并没有大大降低,反而存在进一步的损伤,即心脏缺血再灌注损伤。大量研究证实氧自由基的累积,钙离子超载,炎症细胞浸润,线粒体功能障碍,细胞过度肿胀等病理因素参与了心脏缺血再灌注损伤的病理机制。心脏缺血再灌注损伤是一个复杂的,多因素的病理过程,仍需要我们进一步的深入研究。越来越多的证据表明,氧化应激、细胞内Ca2+超载、炎症、代谢紊乱等多种因素是心肌缺血再灌注损伤的发病机制,这些因素扰乱了内质网的正常功能,导致内质网应激。内质网是细胞主要的细胞器,参与各种蛋白质的合成、成熟和运输。为了挽救失衡的内质网蛋白折叠能力,维护内质网正常功能,细胞进行了未折叠蛋白反应(unfolded protein reaction,UPR)以保护自己,这种反应是进化保守的。通过三条信号通路:PERK,IRE1/XBP1和ATF6,UPR减弱了翻译,增加了参与UPR功能的蛋白的生产。然而,内质网应激是一把双刃剑,过度的UPR会促进细胞凋亡。溶血磷脂酰胆碱(LPC),又称溶血卵磷脂,是由磷脂酶A2(PLA2)裂解卵磷脂(PC)而来的一类脂质生物分子。研究发现心肌缺血再灌注时,LPC在心脏积聚,可作为心肌梗死的诊断标志物。我们一般把磷脂酶A2分为以下三类:分泌型、胞质型和Ca2+非依赖型(iPLA2).其中iPLA2β参与多种生理现象,如钙稳态和细胞凋亡。这种酶最初是从心肌组织中分离出来的,在缺血时被激活,它表现出一些特定的特性,包括钙离子非依赖性、亲在sn-2位置含有花生四烯酸的缩醛磷脂、在Ca2+存在时钙调蛋白(CaM)对其的抑制以及其与ATP的相互作用。iPLA2β的细胞定位具有组织特异性和动态变化。iPLA2β易位到不同的细胞器,包括质膜、内质网、线粒体和核膜,执行不同的功能。既往有研究报道抑制iPLA2β酶的活性后,减轻了细胞凋亡。然而,iPLA2β在不同信号级联中的作用机制及其在疾病中的作用尚不清楚。因此,我们提出这一假设:在心脏缺血再灌注损伤中iPLA2β的表达升高,心肌细胞膜磷脂代谢失衡,激活内质网应激,而失衡的内质网应激导致了心肌细胞的凋亡。第一部分 心脏缺血再灌注损伤中iPLA2β表达以及内质网应激的变化目的观察心肌在缺血再灌注损伤中LPC浓度及iPLA2β表达的变化。观察在缺血再灌注损伤中是否发生了内质网应激,并检测内质网应激相关蛋白,如分子伴侣GRP78的表达与XBP1的剪切。方法与结果收集急性心肌梗塞患者术后24小时内血清,ELISA法检测LPC及磷脂酶iPLA2β的含量,与非心肌梗死病人相比,LPC浓度上升近5倍(P<0.05),iPLA2β浓度是对照组的4倍(P<0.05)。建立小鼠心肌缺血再灌注模型,结扎左前降支45min,再灌后6,24,72小时收集心脏组织样本,检测LPC浓度,发现LPC浓度在24小时上升最为明显,检测iPLA2β表达量,发现在mRNA与蛋白质水平是都是假手术组的2倍左右。构建体外心肌缺氧再复氧模型模拟缺血再灌注损伤,通过调整缺氧时间和复氧时间,发现乳鼠心肌经过3个小时的缺氧和3小时复氧处理后,导致20%左右的细胞死亡约为正常对照组细胞死亡的4倍(P<0.05)。显微镜下可以观察到明显的细胞形态的改变。通过ELISA试剂盒测定LPC,可以观察到经过缺氧后细胞内LPC的浓度是对照组的3倍,而细胞上清中LPC的浓度是对照组的2倍。在内质网应激方面,我们检测到分子伴侣GRP78的表达升高,并且XBP1的剪切也显著增多。结论体内外心肌缺血再灌注损伤可以诱导iPLA2β表达增加并且激活内质网应激。第二部分 iPLA2β在心脏缺血再灌注损伤中的作用目的为了明确iPLA2β在心脏缺血再灌注中的作用,构建iPLA2β全敲小鼠,在心脏缺血再灌注损伤模型中观察其保护作用,同时在体外模型中,敲降或抑制iPLA2β,观察其在心肌细胞缺氧再灌注中的保护作用以及具体的机制。方法与结果我们通过CRISPR/cas9介导的基因组工程构建Pla2g6敲除小鼠模型(C57BL/6N),并将同窝野生型的小鼠作为实验对照组,所有小鼠都给予结扎左前降支45分钟,再灌注24小时的缺血再灌注手术处理。提取心脏组织并用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)进行染色,统计发现敲除组缺血再灌注后的心梗面积显著减少(p<0.05),并且降低TUNEL 阳性率。在原代乳大鼠心肌细胞中转染iPLA2β小干扰RNA,敲降酶iPLA2β,或用抑制剂BEL抑制iPLA2β,观察到缺氧再灌注中心肌细胞的死亡率和TUNEL 阳性细胞显著减少。结论Pla2g6敲除的小鼠减小由于心肌缺血再灌注导致的心梗面积,降低心肌细胞凋亡,体外实验中,敲降或抑制iPLA2β,降低心肌细胞缺氧再灌注后死亡率及细胞凋亡。第三部分 iPLA2β在原代乳大鼠心肌细胞缺氧再灌注中诱导凋亡的作用及机制的研究目的观察敲降iPLA2β在心肌细胞模拟缺血再灌注损伤模型中对细胞凋亡的影响,进一步检测iPLA2β在心肌细胞模拟缺血再灌注损伤中的细胞器分布情况,以及iPLA2β在内质网应激诱导的细胞凋亡中的促进作用。方法和结果在原代乳鼠心肌细胞中用小干扰RNA或化学抑制剂BEL敲降或抑制iPLA2β,缺氧再灌注处理后,流式细胞仪检测细胞凋亡,观察到细胞凋亡的减少。并且细胞膜蛋白pull-down实验发现缺氧再灌注导致胞膜上iPLA2β分布减少。此外,通过细胞免疫荧光共定位我们发现在细胞缺氧再灌注后iPLA2β与内质网共定位增加,且敲降或抑制iPLA2β通过ATF4-PERK-eIF2α-CHOP途径减少细胞凋亡,并且减少了胞内钙离子浓度。结论:iPLA2β可以通过内质网应激诱导的凋亡途径及调节胞内钙离子浓度参与心肌缺血再灌注损伤。
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