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背景:由于胃的位置和功能特点,胃黏膜屏障经常会遭受各种内源性和外源性损伤,胃黏膜上皮损伤成为消化道疾病常见的病变。胃上皮组织中存在干/祖细胞,在胃黏膜损伤后的上皮细胞增殖和组织愈合过程中发挥重要的作用。胃上皮干/祖细胞快速增殖和抑制局部炎症反应在促进损伤胃黏膜修复中起着关键作用,然迄今尚缺乏同时具有胃上皮干/祖细胞快速增殖和抑制炎症反应的特异性作用靶点发现。我们先前研究提示锚定蛋白重复结构域22（Ankyrin repeat domain-containing protein 22,ANKRD22）可能在胃黏膜损伤修复中具有潜在作用。目的:探究ANKRD22对于胃损伤黏膜修复的调控作用;阐明ANKRD22参与胃上皮干/祖细胞快速增殖和胃组织局部炎症反应的分子机制;探讨ANKRD22的抑制性小分子先导化合物作为新型胃黏膜修复保护剂的可能性。方法:通过生信分析及免疫组化分析人胃上皮中ANKRD22的表达,荧光共定位和线粒体分离判断其亚细胞定位。RT-q PCR和Western blot检测胃疾病状态及炎症损伤中ANKRD22的表达改变。我们基于CRISPR/Cas9构建Ankrd22-/-小鼠,用HCl/Et OH灌胃方法建立小鼠急性胃黏膜损伤模型。利用Lgr5-EGFP-IRES-cre ERT2小鼠观察胃黏膜受损区域Lgr5+细胞比例变化,并用PCR鉴定Lgr5+细胞的多向分化潜能。Organoid培养和流式细胞术评价ANKRD22对Lgr5+胃上皮干/祖细胞增殖的影响。RT-q PCR探究ANKRD22缺失后其他胃上皮干/祖细胞标志物的表达改变。荧光共聚焦观察ANKRD22对于线粒体Ca2+浓度的影响。Western blot检测ANKRD22缺失后Wnt-Ca2+通路下游蛋白表达改变。流式细胞术检测敲除Ankrd22后胃组织炎症细胞浸润数量变化。ELISA试验和Luminex抗体芯片探究ANKRD22对炎症因子分泌和巨噬细胞M1/M2极化的调控作用。荧光共聚焦和Western blot检测Ankrd22敲除造成的巨噬细胞线粒体Ca2+浓度和NFAT表达变化。进一步,我们通过虚拟筛选获得ANKRD22抑制性先导化合物,用Ca2+荧光染色鉴定其作用位点,并通过萤光素酶报告方法和小鼠模型进行体内外功能验证。结果:1.ANKRD22在急性胃黏膜损伤状态下调利用生信分析及免疫组化我们发现胃上皮细胞广谱高表达ANKRD22。荧光共定位和线粒体分离示ANKRD22大部分定位于线粒体。在Hp感染和胃癌的疾病状态以及胃上皮炎症损伤中ANKRD22表达呈下降趋势。动物模型可见Ankrd22敲除对于HCl/Et OH诱发的小鼠急性胃黏膜损伤具有修复效应。2.ANKRD22缺失促进Lgr5+胃上皮干/祖细胞快速增殖ANKRD22缺失促进胃上皮干/祖细胞标志物Lgr5的表达。小鼠胃黏膜受损区域下方Lgr5+细胞较非损伤区域明显增加,且PCR检测示这些Lgr5+细胞具有多向分化潜能。经化学性损伤刺激后,Ankrd22-/-小鼠胃上皮Organoid克隆形成数和Lgr5+胃上皮干/祖细胞数量相比对应Ankrd22+/+小鼠显著增加。人慢性胃组织炎症样本中ANKRD22与LGR5具有负相关性。3.ANKRD22缺失抑制非经典Wnt-Ca2+信号通路Ca2+荧光染色观察到ANKRD22缺失降低了胃上皮细胞线粒体内Ca2+水平。在鉴定抑制非经典Wnt-Ca2+通路对经典Wnt通路活性具有上调作用的基础上,我们发现ANKRD22缺失抑制了非经典Wnt-Ca2+通路下游DAG、p-Ca MKII和NFAT的表达,从而间接上调经典Wnt通路。4.ANKRD22缺失通过抑制巨噬细胞活化减轻胃黏膜炎症反应流式细胞术表明Ankrd22-/-小鼠炎症损伤胃上皮CD45+细胞比例较Ankrd22+/+小鼠明显减少。芯片分析和ELISA鉴定示敲除Ankrd22会降低炎症因子IL-1α和TNF-α水平。ANKRD22表达在活化的巨噬细胞中增高,而敲除Ankrd22下调了炎症因子的分泌,减少了向M1型极化的巨噬细胞。机制上ANKRD22缺失通过减少线粒体Ca2+浓度和胞浆NFAT水平从而抑制了巨噬细胞活化。5.ANKRD22抑制性小分子先导化合物的筛选和体内外功能验证我们筛选到以L122/D132为作用位点的ANKRD22抑制性先导化合物-AV023,其能在体内外促进Lgr5+胃上皮干/祖细胞增殖并减轻炎症反应,上调Wnt通路活性,腹腔注射AV023具有促进小鼠损伤胃黏膜修复的作用。结论:我们发现胃上皮广泛表达的线粒体分子ANKRD22在胃黏膜损伤时表达下调;抑制ANKRD22表达可通过降低胃上皮细胞线粒体内Ca2+浓度和胞浆NFAT的表达,间接上调经典Wnt通路而促进Lgr5+胃上皮干/祖细胞的增殖;同时也通过抑制巨噬细胞分泌细胞因子,从而减轻了胃黏膜炎症反应。最后,我们鉴定了ANKRD22抑制性小分子先导化合物的促黏膜修复作用。这些研究提示ANKRD22是一个新的促进胃黏膜修复的潜在分子靶标,ANKRD22抑制性小分子先导化合物AV023具有潜在的临床应用前景。