血吸虫病(Schistosomiasis)是由血吸虫(Schistosome)感染所引起的一种严重危害人、畜健康的寄生虫病,流行于全球74个国家和地区,约有5-6亿人受到威胁。目前,防治血吸虫病的主要策略是依赖于治疗药物吡喹酮的广泛应用,然而,防治实践已表明单依靠药物治疗不能解决重复感染的问题,并且,药物的不断使用可能会引起抗药性虫株的出现。因此,筛选、鉴定新的抗血吸虫病的候选疫苗分子和药物靶标显得尤为重要。血吸虫生活在宿主的血管中,需要氧化还原酶来抵抗宿主免疫系统或者血吸虫自身代谢产生的活性氧自由基(ROS),血吸虫缺乏过氧化氢酶,也没有TrxR和GR这两种酶,取而代之的是一种多功能酶——硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(TGR),该酶具有TrxR. GR和Grx三种酶的功能。鉴于这种独特性,对TGR的研究受到寄生虫学者的重视。本文以rSjTGR作为研究对象,开展了动物免疫保护效果评估及机制分析,酶特性和基因功能分析,以及金诺芬对SjTGR抑制作用分析,为深入了解SjTGR在日本血吸虫生长发育中的作用提供了基础。1、重组日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)免疫保护作用及机制分析应用重组蛋白硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶rSjTGR开展了小鼠免疫保护试验,结果显示,在两次独立的免疫保护试验中,rSjTGR分别诱导了33.5%和36.51%的减虫率,平均值为35.00%,并且还诱导了33.73%和43.44%的肝脏减卵率,平均值为38.58%。该结果与佐剂对照组相比,差异非常显著(P<0.01)。在此基础上,本研究进一步应用ELISA技术对rSjTGR诱导的免疫保护机制进行了初步探讨,结果表明,rSjTGR诱导免疫小鼠产生了较高水平的IgG1特异性抗体和IFN-γ,提示rSjTGR诱导小鼠产生了Th1和Th2混合型,但偏向于Th1型的免疫应答。研究结果表明rSjTGR值得作为日本血吸虫病候选疫苗分子进行深入的研究。2、重组日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)酶活性及抗氧化作用分析本研究应用酶学分析技术分析了重组蛋白rSjTGR的酶活性,结果显示,rSjTGR具有TrxR、GR和Grx三种酶的活性,分别为1.877±0.169 U/mg,0.8±0.01 U/mg, 51.286±4.62 U/mg.该重组蛋白发挥作用的最适温度为25℃,最佳pH值为7。本研究还分析了rSjTGR的抗氧化作用,发现rSjTGR主要靠清除活性氧参与抗氧化作用,而对H2O2没有直接清除作用。本研究证明了重组蛋白SjTGR具有酶活性,为深入研究rSjTGR的生物学功能奠定了基础。3、RNA干扰日本血吸虫TGR基因对虫体生长发育的影响本研究针对TGR基因合成了4对小RNA分子(siRNAs):S1 siRNA、S2siRNA、 S3 siRNA和S4 siRNA,通过体内、体外干扰试验分析siRNAs对SjTGR的沉默效果。结果发现,在体外试验中,S2 siRNA在浓度为200 nM时可以在转录和蛋白水平上引起部分TGR基因表达的下调。在感染过日本血吸虫的小鼠体内,与对照组相比,S2siRNA处理组分别诱导了23.16%和36.19%的减虫率,平均值为29.68%。并且,S2siRNA处理组中的虫体TrxR酶活性下降。本研究结果表明,SjTGR在日本血吸虫生长发育中具有重要的作用。4、日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)作为金诺芬(AF)药物靶标分析金诺芬是一种对某些硒蛋白有抑制作用的合金化合物。本研究通过体内、外试验探讨了AF对SjTGR的抑制作用。结果发现,12.5 μ,M的AF对rSjTGR的抑制作用高达64.29%,但随着AF的浓度升高,抑制效果并不会随之升高。此外,通过对不同期别虫体的分析,发现AF对成虫SjTGR的抑制效果低于对童虫的效果,分析可能与虫体对环境和应激的适应性有关。AF作用童虫3h后,童虫全部死亡。10μM的AF作用于成虫1h后,提取虫体蛋白检测ΓrxR, GR和Grx的活性发现,抑制效果分别为85%、69%和58%。体内注射AF的BALB/c小鼠获得39.18%的减虫率。实验证明,AF对SjTGR有较强的抑制作用。但AF能否作为一种新的抗血吸虫药物,还需要进一步深入的研究。