子宫内膜癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,其发病率逐年上升。其中70%一80%为I型子宫内膜癌(内膜样腺癌),其与长期雌激素刺激,缺乏孕激素拮抗密切相关。目前对子宫内膜癌,尤其是年轻I型子宫内膜癌及其癌前病变患者,大剂量孕激素治疗仍然是最主要的保守治疗方法,但是其具体的作用机制仍不明确。近年来子宫内膜癌的发病愈来愈年轻化,如何早期发现子宫内膜癌和深入研究孕激素治疗子宫内膜癌的机制具有重要的现实意义。既往研究认为孕激素可以通过与细胞核孕激素受体(progesterone receptor, PR)结合诱导后续级联反应抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。本课题组采用反向蛋白芯片技术(reverse phase protein array, RPPA)研究子宫内膜癌细胞株Ishikawa及采用孕激素诱导而来的孕激素耐药细胞株progestin-R Ishikawa时发现,两种细胞株孕激素刺激后存在毛细血管扩张性共济失调突变基因蛋白(ataxia-telangiectasia, mutated, ATM)的差异性表达,在Ishikawa中孕激素能够上调ATM的表达,在progestin-R Ishikawa细胞中则没有。ATM蛋白为A-T (ataxia-telangiectasia)基因编码蛋白,是磷酸肌醇3-激酶(Phosphoinositide3-kinase, PI3-K)相关激酶家族的一员,是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,ATM基因突变导致机体无法产生完整有功能的ATM蛋白,造成毛细血管扩张性共济失调症、淋巴瘤等一系列疾病。ATM在DNA双链断裂修复(DNA double strand breaks DSB)和启动细胞凋亡程序中起关键性调控作用。许多因素,包括放射线、化疗药物如顺铂、阿霉素以及癌基因蛋白Myc等均通过激活ATM,启动ATM-Chk2-P53信号通路,诱导细胞凋亡,其表达异常或者功能缺失与肿瘤的发生及耐药密切相关。二甲双胍被证明在子宫内膜癌中可以上调孕激素受体表达,还可以改善多种恶性肿瘤的治疗,但是二甲双胍对子宫内膜癌治疗作用机制尚不清楚。故本研究探讨ATM在孕激素治疗子宫内膜癌中的作用及机制,同时初步探索二甲双胍治疗子宫内膜癌与ATM之间的关系。本课题共分为三部分：一、ATM在I型子宫内膜癌及其癌前病变中的表达情况。二、ATM在孕激素治疗子宫内膜癌中的作用及机制研究。三、二甲双胍治疗子宫内膜癌与ATM关系的初步探索。第一部分：ATM在Ⅰ型子宫内膜癌及其癌前病变中的表达情况目的：检测ATM在Ⅰ型子宫内膜癌及其癌前病变中的表达情况,同时研究子宫内膜癌组织中ATM表达与临床病理分期、PR. ER (estrogen receptor)、P53、 CK7、Ki67、Vimentin等指标之间的关系。方法：1.采用免疫组化方法研究139例正常及增生性病变子宫内膜组织：包括增生期子宫内膜8例,分泌期子宫内膜6例,单纯性增生过长10例,复杂性增生过长13例,不典型增生过长11例,I型子宫内膜癌91例,ATM在其中的表达情况。2.采用免疫组化方法研究91例子宫内膜癌组织(I级58例,II级17例,Ⅲ级8例,另8例资料不全予剔除)中ATM、PR、ER、P53、CK7、Ki67、 Vimentin表达情况。3.采用SPSS19.0进行分析,以P=0.05为显著性统计学差异标准。结果：1.采用秩和检验各组ATM表达情况,各组平均秩分别为：增生期：112.50；分泌期：129；单纯性增生过长：78.25；复杂性增生过长：71.04；不典型增生过长：70.05；Ⅰ型子宫内膜癌：59.58.ATM表达组间存在显著差异(P＝O.000)。与增生期子宫内膜相比,分泌期子宫内膜ATM表达最高,子宫内膜增生性病变各组ATM表达随病变程度加重呈逐渐下降,在Ⅰ型子宫内膜癌中表达最低。2.Ⅰ型子宫内膜癌组织中ATM表达与病理级别呈负相关(Kendall系数=-0.269,P=0.011)。ATM表达情况与病例FIGO分期、肌层浸润情况无显著相关性(P>0.05),与其余指标(P53、PR、ER、CK7、Vimentin、Ki67)也无显著相关(P>0.05)。结论：1.ATM在Ⅰ型子宫内膜癌及其癌前病变中表达显著低于正常子宫内膜,ATM表达降低可能与子宫内膜癌相关；2.ATM在分泌期表达高于增生期,提示其表达可能与孕激素相关；3.ATM表达与子宫内膜癌的病理级别呈负相关,进一步提示ATM低表达或者缺失可能与子宫内膜癌的恶性程度相关；4.子宫内膜癌中ATM表达与病例FIGO分期、肌层浸润、P53、PR、ER、CK7、Vimentin、Ki67等无相关性。第二部分：ATM在孕激素治疗子宫内膜癌中的作用及机制研究目的：研究ATM在孕激素治疗子宫内膜癌中的作用及机制。方法：采用三组子宫内膜癌细胞株：孕激素受体阳性细胞株：Ishikawa和RL95-2,孕激素受体阴性细胞株：progestin-R Ishikawa作为研究对象；采用Western Blot检测孕激素作用后ATM表达情况；采用siRNA方法沉默ATM基因表达；采用CCK-8检测细胞在ATM沉默前后孕激素抑制细胞增殖情况；采用流式细胞技术检测在ATM沉默前后孕激素促凋亡情况。采用western blot检测ATM沉默前后ATM-CHK2-P53-caspase3信号通路中节点蛋白表达情况。结果：1.孕激素治疗后Ishikawa、RL95-2细胞中ATM表达上调,对progestin-R Ishikawa中ATM表达无影响。2.沉默ATM后孕激素抑制Ishikawa、RL95-2细胞增殖作用被抑制,在Ishikawa细胞,沉默ATM前后孕激素抑制率分别为20.10%和2.93%,在RL95-2细胞为25.2%和0.03%；沉默ATM前后,孕激素对progestin-R Ishikawa均无明显抑制作用。3.沉默ATM不能阻断孕激素对Ishikawa、RL95-2的促凋亡作用,在Ishikawa细胞沉默ATM前后孕激素诱导的凋亡率分别为16.87±0.44(%)和17.86±0.72(%)(P=0.0213),在RL95-2细胞为12.80±0.89(%)和15.67±0.72(%)(P=0.0373)；沉默ATM前后,孕激素对progestin-R Ishikawa细胞均无明显促凋亡作用。4.在Ishikawa和RL95-2细胞,孕激素能够上调ATM、PChk2、Chk2、p-P53、P53和caspase3表达,沉默ATM后,孕激素上调作用被抑制；在progestin-R Ishikawa细胞,沉默ATM前后,孕激素均不能上调上述蛋白表达。结论：1.孕激素可能通过PR介导活化ATM-Chk2-P53-caspase3信号通路抑制细胞增殖,可能并不通过上述通路参与孕激素促进细胞凋亡作用；2.沉默ATM表达,能够阻断孕激素抑制细胞增殖作用,但是不能完全阻断其促凋亡作用,可能存在其它信号通路的活化或其它作用机制的激活。第三部分：二甲双胍治疗子宫内膜癌与ATM关系的初步探索目的：初步探索二甲双胍治疗子宫内膜癌与ATM的关系方法：采用子宫内膜癌细胞株RL95-2；采用Western Blot检测二甲双胍作用RL95-2后ATM、P53和Chk2表达情况。结果：二甲双胍治疗后RL952细胞中ATM、P53、Chk2蛋白的表达上调。结论：二甲双胍可能可以通过活化ATM-Chk2-P53信号通路诱导子宫内膜癌细胞凋亡,其与孕激素可能具有协同作用,可以作为子宫内膜癌药物治疗研究的一个新靶点。上述结果提示：1.ATM蛋白低表达可能与子宫内膜癌密切相关,病理级别越高,其表达越低。2.孕激素可以上调ATM表达,通过活化ATM-Chk2-P53-caspase3信号通路抑制细胞增殖,沉默ATM可以阻断孕激素抑制增殖作用,但不能完全阻断其促凋亡作用。3.二甲双胍可能通过活化上述通路诱导细胞凋亡,其可以作为子宫内膜癌药物治疗研究的一个新靶点。本课题研究表明：ATM表达缺失可能与子宫内膜癌的发生、发展密切相关；ATM-PR-Chk2-P53-caspase3信号通路是孕激素作用于子宫内膜癌细胞的重要通路之一。二甲双胍作为胰岛素增敏剂,可能也通过活化上述通路诱导细胞凋亡,该研究为孕激素治疗子宫内膜癌提供了新的思路,新的研究方向。