【摘 要】
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鸡马立克氏病(MD)是鸡的一种高度传染性淋巴细胞增生性疾病,由马立克病毒(Marek’s Disease Virus,MDV)引起,能够引起鸡群较高的发病率和死亡率,是危害养鸡业健康发展的主要疫病之一。马立克氏病是可以用疫苗预防的由病毒引起的肿瘤性疾病,提供了利用自然宿主来研究淋巴瘤形成的疾病研究的模型,常被国内外用做病毒性肿瘤研究和治疗的模型。长链非编码RNA(Lnc RNA)在许多肿瘤中有异常
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鸡马立克氏病(MD)是鸡的一种高度传染性淋巴细胞增生性疾病,由马立克病毒(Marek’s Disease Virus,MDV)引起,能够引起鸡群较高的发病率和死亡率,是危害养鸡业健康发展的主要疫病之一。马立克氏病是可以用疫苗预防的由病毒引起的肿瘤性疾病,提供了利用自然宿主来研究淋巴瘤形成的疾病研究的模型,常被国内外用做病毒性肿瘤研究和治疗的模型。长链非编码RNA(Lnc RNA)在许多肿瘤中有异常表达,从而影响肿瘤发生相关基因的表达,可能促进或抑制肿瘤的形成和发展。本研究通过蚀斑试验对MDV BJ-1株血毒病毒滴度检测,以1000pfu/只鸡的攻毒剂量攻毒SPF鸡以建立鸡MD肿瘤模型,42d时剖检攻毒组鸡和对照组鸡,并记录死亡率和致瘤率。通过MD琼脂扩散试验检测病毒感染情况,并且通过剖检观察鸡脾脏、肝脏、肠道等组织器官病变,确定成功构建MD肿瘤模型。采集鸡MD脾脏肿瘤和正常脾脏组织,通过RNA-seq测序技术,进行转录组测序分析,对差异表达基因数据库、差异表达Lnc RNA数据库、信号通路数据库和Lnc RNA靶基因库等进行分析,构建基因的共表达网络,并对p53相关Lnc RNA进行体外功能验证分析。研究结果表明,MDV感染鸡与正常对照相比,筛选出22181个差异表达Lnc RNAs;对差异表达基因数据库、信号通路数据库和共表达数据库的分析结果表明,共筛选出1010个差异表达基因(P<0.05),被注释到475条差异表达信号通路中;330条差异上调表达信号通路(P<0.05),富集了618个差异上调表达基因,其中有91个基因差异极显著(P<0.01);145个差异下调表达信号通路(P<0.05),富集了392个差异下调表达基因,其中有38个基因差异极显著(P<0.01),GO功能分析差异表达基因富集到20个生物学功能显著相关的条目。利用Pathway显著性富集分析,以KEGG Pathway为单位,差异表达基因富集到9条信号通路中。采用WGCNA(weighted correlation network analysis)构建权重相关性网络,从表达水平上分析Lnc RNA与m RNA之间互作关系,结果显示有2349个Lnc RNAs预测到相应的靶基因。对研究获得与肿瘤相关蛋白p53的TP53BP1-Lnc RNA进行体外功能验证。通过构建TP53BP1-Lnc RNA-sh RNA干扰载体,通过脂质体转染DF-1细胞,应用q PCR等技术对TP53BP1-Lnc RNA的转录水平进行检测,并从中选出最佳干扰组。提取最佳干扰组和对照组的DF-1细胞的总蛋白,应用Western blot技术检测p53蛋白表达量。结果表明,转染TP53BP1-Lnc RNA-sh RNA-2干扰载体后的DF-1细胞中TP53BP1-Lnc RNA的RNA水平表达量极显著降低(P<0.01);转染TP53BP1-Lnc RNA-sh RNA-3、TP53BP1-Lnc RNA-sh RNA-4干扰载体后的DF-1细胞中TP53BP1-Lnc RNA的RNA水平表达量显著降低(P<0.05)。转染干扰载体后的DF-1细胞与对照组相比的p53基因的RNA表达水平显著降低(P<0.05),p53蛋白的表达量极显著降低。TP53BP1-Lnc RNA体外干扰验证结果显示,该Lnc RNA对p53基因的转录及蛋白表达水平均有影响,与RNA-seq结果一致,TP53BP1-Lnc RNA对p53蛋白表达水平的影响是直接还是间接影响,还需要进一步深入探讨。本研究通过高通量测序技术和生物信息学分析技术,对MDV感染鸡脾脏基因转录水平、基因与Lnc RNA共表达网络的构建,获得了新Lnc RNAs与差异表达基因的共表达网络,并对获得的与p53蛋白表达相关的TP53BP1-Lnc RNA进行了体外功能验证,研究结果将从Lnc RNA调控基因表达的角度对病毒性肿瘤形成分子机制的研究提供参考。
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