1目的意义应激性溃疡是以胃黏膜充血、水肿、糜烂和出血等为主的急性胃黏膜病变,其发生机制比较复杂,且尚未完全阐明。目前认为SU的发生涉及胃黏膜屏障的损害、胃酸、氧自由基、神经内分泌等多因素综合作用的结果。褪黑素(Melatonin,MT)是目前已知作用最强的内源性抗氧化剂,胃肠道组织存在MT受体。大量研究表明褪黑素对各种实验性胃损伤有保护作用。MT对消化道疾病的影响和在胃肠道中的作用被逐步认识,其在急性胃黏膜损害中发挥的保护作用受到重视,对MT的深入研究有助于应激性溃疡诊治水平的提高。中医认为应激性溃疡属“血证”、“胃脘痛”范畴,其病因病机大多与热、虚、瘀有关。中药对防治应激性溃疡有一定的疗效和优势。如何选择合适的药物进行必要的预防并减少毒副作用是人们研究SU的重点和难点。近年来研究表明MT与应激引起的急性胃黏膜损伤关系密切,但是目前的实验研究多为外源性给予药理剂量的MT,由于胃黏膜组织存在MT受体及能合成生理浓度的MT,内源性MT对胃生理功能的调节及抗损伤的作用未见报道。益气活血法是中医临床防治SU的治法之一,代表药物有黄芪、三七等。前期工作对中药抗溃疡、抗胃黏膜损伤作用机制研究及益气健脾中药对脾虚大鼠壁细胞功能形态研究积累了大量科研数据,发现益气活血法具有抗胃黏膜损伤和促进其修复的功能,并能改善胃黏膜壁细胞的病理形态及功能状态。三七总苷(total saponins of Panax notognseng,PNS)是五加科人参属植物三七的主要有效活性成分,含有多种单体皂苷,具有扩张血管、降低心肌耗氧量、抑制血小板聚集、延长凝血时间、改善微循环、降血脂、清除自由基、抗炎、抗氧化等药理作用。近年来研究证实,PNS对心、肝、肺、肾、脑等重要器官具有良好的抗氧化损伤作用,并表明其保护机制主要是通过清除自由基来实现的。因此,催生了将三七及三七总苷引入抗应激性溃疡的实验和临床研究,这也是我们研究思路的出发点。本研究立足中医药防病治病的优势,并在广州中医药大学脾胃研究所前期工作基础上,根据中医药理论,以益气活血为法则,预先给予PNS,观察其对SU发病机制中胃黏膜MT受体表达及胃黏膜细胞氧化应激的影响。从三七总苷调节内源性MT受体环节上,重点探讨其抗应激性胃黏膜损伤作用机制和预防机制。2内容与方法本研究共分为三个部分:三七总苷对应激大鼠胃黏膜损伤及胃壁细胞超微结构的影响;三七总苷对应激大鼠胃黏膜氧自由基的影响;三七总苷对应激大鼠胃黏膜褪黑素受体mRNA表达的影响。本研究的完成,可为多层次研究SU的发病机制及防治提供新的思路和研究方向;可为褪黑素、三七总苷扩大药效范围和保证临床用药安全,提供可靠的实验数据;对探讨抗应激性溃疡的中医治法理论及新型抗SU中药制剂的开发都具有重要的理论意义。2.1 SU大鼠模型的复制及评价采用经典水浸-束缚应激模型。大鼠禁食24 h后,在轻度乙醚麻醉下,将四肢及头部束缚于鼠板上,待清醒后将鼠板垂直浸入(19±1)℃水浴中,水面平胸骨剑突。持续时间6 h。所有动物分别于造模后处死,取胃观察胃黏膜形态和损伤程度(Guth法计算溃疡指数,UI)。2.2大鼠胃黏膜上皮细胞超微结构观察——透射电镜标本制备取胃窦部组织进行固定、切片,醋酸铀和枸橼酸铅双重染色,电子显微镜观察并拍照。电子显微镜由专业技术人员协助操作。2.3大鼠胃黏膜MT1受体mRNA检测胃黏膜总RNA提取参照RNAiso Reagent提取说明书进行。提取产物经紫外分光光度计定量后进行逆转录。逆转录产物进行PCR反应,MT1受体上游:5’-GTGCTACGTGTTCCTGATATGG-3’,下游:5’-GGATCTGAGGCCACAATA AGAC-3’,360bp;GAPDH上游:5’-CTACCCACGGCAAGTTCAAT-3’,下游:5’-ACTGTGGTCATGAGCCCTTC-3’,382bp。PCR反应条件:94℃1min变性,55℃1min退火,72℃2min延伸,40个循环。PCR产物进行琼脂糖电泳,经KODAK 1D Image成像系统分析,以目的基因(MT1受体)与内参(GAPDH)光密度比值表示MT1 mRNA的相对表达量。2.4大鼠血清、胃黏膜氧化应激指标检测取各组大鼠血清及胃黏膜匀浆,按试剂盒测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)含量。3结果与结论3.1三七总苷对应激大鼠胃黏膜损伤及胃壁细胞超微结构的影响实验结果证实水浸-束缚应激后,胃黏膜出现广泛的糜烂、出血,并有溃疡形成。通过UI及抑制率比较,发现三七总苷可以明显减轻应激对胃黏膜的损伤,说明其对应激大鼠胃黏膜具有保护作用。实验发现,大鼠经水浸-束缚应激后致急性胃黏膜损伤的同时,壁细胞呈现不同程度的激活状态,尤以模型组为明显,壁细胞内分泌小管绒毛密集,胞浆内囊泡基本消失,呈明显的泌酸激活状态,并且这些超微结构的变化与胃黏膜损伤的大体观察相一致。提示应激因素可以激活壁细胞泌酸功能,从而加重胃黏膜损伤,而三七总苷可促进胃黏膜壁细胞从激活状态向静息状态转化,这可能是其抗应激性胃黏膜损伤作用机理之一。3.2三七总苷对应激大鼠血清及胃黏膜氧自由基的影响本研究结果显示,模型组应激6 h后,胃黏膜中NO含量比正常对照组降低,MDA含量增高,SOD活性下降,说明水浸-束缚应激后产生了大量氧自由基,使SOD消耗量增加,氧自由基酶性清除系统遭到损伤,造成胃黏膜损伤。经PNS治疗后,NO含量略升高,MDA含量下降,SOD活性增加,提示PNS能够提高SOD活性,增强对氧自由基的清除能力,从而起到胃黏膜保护作用。结果还显示,模型对照组血清中NO含量比正常对照组降低(P＜0.01),MDA含量增加,SOD活性下降,说明血清中发生的氧自由基损害与胃黏膜是同步的。经PNS治疗后,大鼠血清中NO含量升高,但MDA和SOD含量与模型组比较,差异无统计学意义,说明胃对氧化应激非常敏感,具有器官特异性,氧自由基损伤主要发生在胃黏膜。3.3三七总苷对应激大鼠胃黏膜褪黑素受体mRNA表达的影响结果显示,所有以MT1受体为引物的RT-PCR产物中,均可见360bp的阳性条带,说明大鼠胃黏膜中确实存在MT1受体mRNA的表达。结果显示,应激大鼠模型组MR的相对含量与正常组比较,略有降低,但差异无统计学意义;三七总苷组、雷尼替丁组与正常组和模型组比较,MR的相对含量均升高,差异均有显著性(P＜0.05～P＜0.01),说明三七总苷组和雷尼替丁均有上调应激大鼠胃黏膜中MR的作用,其机理可能与三七总苷和褪黑素都积极参与了抗自由基氧化损伤的过程,它们具有协同作用。因此,能在胃黏膜中测到MR的高表达,这为三七总苷间接调控内源性MT,共同起到保护胃黏膜的作用提供了实验依据。