【摘 要】
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目的:粉莲花精油（pink lotus essential oil,PLEO）是提取自粉莲花花朵的一组挥发性组分。粉莲花自古便被用作中药材,但PLEO的相关研究较少,且其易挥发的不稳定性要求在做特殊使用时需要剂型的保护。本文拟分析PLEO精油的化学成分,检测其体外抑菌,抗炎和促进细胞增殖的活性,并将其制备成微胶囊,混入温敏水凝胶材料中制成水凝胶,探究其对伤口愈合的治疗作用。方法:采用气相-质谱联用
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目的:粉莲花精油（pink lotus essential oil,PLEO）是提取自粉莲花花朵的一组挥发性组分。粉莲花自古便被用作中药材,但PLEO的相关研究较少,且其易挥发的不稳定性要求在做特殊使用时需要剂型的保护。本文拟分析PLEO精油的化学成分,检测其体外抑菌,抗炎和促进细胞增殖的活性,并将其制备成微胶囊,混入温敏水凝胶材料中制成水凝胶,探究其对伤口愈合的治疗作用。方法:采用气相-质谱联用技术分析PLEO的化学成分,并采用抑菌圈法测定其对金黄葡萄球菌,绿脓杆菌和表皮葡萄球菌的抑菌活性。采用MTT法检测细胞活力。采用酶联免疫吸附测定法（enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA）测定脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）和人皮肤成纤维细胞（human skin fibroblast,HSF）中的炎症因子肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α,TNF-α）,白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）和白细胞介素1-β（interleukin-1β,IL-1β）。采用细胞划痕实验测定细胞迁移能力。用β-环糊精包合PLEO制成微胶囊,通过单因素法对核壳比,温度,搅拌速度和搅拌时间工艺条件进行筛选,并通过响应面法模拟实验设计,将包封率设定为响应值,确定PLEO微胶囊制备的最佳工艺。利用扫描电子显微镜观察PLEO微胶囊的形态特征,使用马尔文粒度仪测定PLEO微胶囊的粒径、电位和多分散性指数。将PLEO微胶囊加入到温敏材料泊洛沙姆-407和泊洛沙姆-188中,制备PLEO微胶囊温敏水凝胶。通过扫描电子显微镜观察其形态特征,测量其溶胀度和p H,使用流变仪测量其流变学特征。建立小鼠皮肤切口模型,用PLEO微胶囊温敏水凝胶处理,观察其对伤口愈合的影响。采用苏木素-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）和Masson三色染色法观察伤口处皮肤的病理损害和纤维沉积。采用免疫组化染色法观察伤口处皮肤中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I型胶原蛋白和血管内皮生长因子（VEGF）的表达。采用蛋白印迹法分析磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、内皮一氧化氮合成酶（e NOS）和磷酸化e NOS（p-e NOS）蛋白表达水平。结果:PLEO主要由脂肪醛（26.57%）、萜类（25.64%）、脂类（14.89%）和芳香烃（14.23%）组成。PLEO对金黄葡萄球菌,绿脓杆菌和表皮葡萄球菌都具有抑制作用,且与空白对照组有显著性差异（P＜0.05或0.01）。PLEO可使HUVEC和HSF的细胞活力明显增加（与对照组相比,P＜0.05或0.01）。PLEO可抑制LPS诱导的HUVEC和HSF细胞产生TNF-α,IL-6和IL-1β（与LPS组相比,P＜0.05）,具有抗炎活性。PLEO显著促进HUVEC和HSF细胞的迁移（与对照组相比,P＜0.05）。优化得到的PLEO微胶囊的最佳制备工艺是:核壳比1:5,温度:55℃,搅拌速度:550 rpm,搅拌时间:3 h,其包封率可达71.29±0.019%。通过扫描电子显微镜观察到粉莲花精油微胶囊的形态成球形,粒径为57.03±4.18μm,zeta电位约为-17.05±1.85 m V,PDI为0.338±0.02。将PLEO微胶囊混入温敏材料中制备成水凝胶,成胶温度为36℃,扫描电子显微镜显示其三维网状结构良好,溶胀度高,保湿性能好,p H值为6.48±0.18,符合人体皮肤接受范围内。流变学特征数据显示含有PLEO微胶囊的水凝胶的理化特征都与空白水凝胶相似甚至优于空白水凝胶。给小鼠切口用PLEO微胶囊水凝胶处理后,伤口愈合率明显提高（与对照组相比,P＜0.01）。HE染色结果显示PLEO微胶囊水凝胶促进了伤口处皮肤组织的生长,组织形态良好;Masson染色结果显示PLEO微胶囊水凝胶抑制了伤口处的炎症因子,且促进了胶原纤维的沉积。伤口处皮肤组织中α-SMA、I型胶原蛋白和VEGF的表达明显增加,PI3K、p-Akt和p-e NOS的水平都有不同程度的上调（与对照组相比,P＜0.05或0.01）。结论:PLEO组成复杂,萜类成分含量高。PLEO体外具有抑菌抗炎、促进细胞增殖和迁移的作用。制备的PLEO微胶囊水凝胶可显著促进皮肤伤口愈合,这一作用可能与通过激活PI3K/Akt/e NOS信号通路促进成纤维细胞激活和胶原蛋白与血管生成有关。实验结果为治疗干预伤口愈合和PLEO的开发应用提供了新的策略。
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