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小反刍兽疫(Peste des Petits Ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants virus,PPRV)引起山羊、绵羊等小反刍动物的一种急性、烈性和高度接触性传染病。PPRV具有较强的淋巴细胞嗜性,感染宿主后造成机体免疫抑制是PPRV的主要致病特征。白介素1受体相关激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase1,IRAK1)是TLR信号通路及干扰素信号通路中的关键分子,参与机体抗病毒反应。Micro RNA是一类仅有18~25个核苷酸的单链小分子RNA,在宿主抗病毒反应中发挥重要的调控作用。目前,PPRV感染引起机体免疫抑制过程中miRNA起何作用尚不清楚。本研究中,利用PPRV感染山羊外周血单个核细胞(PBMCs)后,根据miRNA高通量测序结果,从中筛选出与Ⅰ型干扰素通路密切相关的miR-3,进一步探究miR-3在PPRV感染引起机体免疫抑制中的作用及其机制,本研究内容和结果如下:1.检测PPRV不同感染剂量(MOI=0.1、1、10)和不同感染时间对山羊PBMCs中miR-3表达水平的影响,q RT-PCR技术检测结果表明:miR-3表达量随着病毒感染剂量增加而升高,随着感染时间延长而升高。分别将含有病毒N、H、M、F、C和V基因的质粒转染PBMCs后,q RT-PCR检测结果表明:转染V蛋白能够显著增加miR-3表达水平。为进一步明确调控miR-3的转录因子,用不同关键信号分子抑制剂处理山羊PBMCs 1 h后感染PPRV(MOI=1),q RT-PCR检测结果表明:PPRV感染山羊PBMCs后主要通过NF-κB及P38通路上调miR-3表达。2.为进一步探究miR-3在PPRV复制中的作用,将不同浓度的miR-3mimic/inhibitor及其相应对照转染山羊PBMCs,转染48 h后感染PPRV并检测病毒增殖水平,Western blot及TCID50检测结果表明:miR-3能够显著增强PPRV在山羊PBMCs中的复制水平以及病毒滴度,且呈剂量依赖性。3.为了探究miR-3对PPRV复制水平调控的作用机制,利用多个生物信息学软件对miR-3和宿主细胞内的靶基因进行了预测,结果表明:miR-3与IRAK1 m RNA的3’UTR互补结合。双荧光素酶报告基因试验进一步表明miR-3可直接靶向IRAK1基因的3’UTR。分别转染不同剂量的miR-3 mimic/inhibitor及其对照,q RT-PCR及Western blot检测结果表明:miR-3能够显著抑制靶基因IRAK1的转录水平及蛋白表达,进一步研究表明:miR-3主要通过靶向IRAK1抑制IRAK1-NF-κB途径介导的IFN-α的产生。4.转染miR-3 inhibitor及其对照至山羊PBMCs,研究不同转染时间对PPRV复制水平以及对IFN-α和干扰素刺激基因(ISGs)表达的影响,结果表明:相较于转染对照组,转染miR-3 inhibitor能够显著促进IFN-α和ISGs的表达水平,而抑制病毒复制水平和病毒滴度。同时,敲低IRAK1的表达则对上述病毒复制水平和病毒滴度具有“拯救”作用。为明确IFN-α对PPRV复制的影响,将miR-3 mimic转染细胞用PPRV感染后与重组IFN-α共孵育,结果显示:IFN-α处理组ISGs的表达水平显著增加,转染miR-3 mimic促进病毒复制的能力可通过重组IFN-α的处理而显著降低。以上结果表明,PPRV感染后诱导的miR-3主要通过抑制IFN-α表达水平来促进病毒复制。此外,基于si-IRF3干扰IRF3表达发现,PPRV感染PBMCs后ISGs能够通过IRF3途径生成。5.为明确PPRV感染山羊和绵羊PBMCs中miR-3表达水平差异,将山羊和绵羊PBMCs感染PPRV(MOI=1)后,分别检测山羊和绵羊PBMCs中病毒复制水平、miR-3和IFN-α表达的差异。结果表明:相较于绵羊,山羊PBMCs中PPRV复制水平和miR-3表达水平更高,IFN-α表达水平更低;山羊和绵羊PBMCs中miR-3表达与IFN-α均呈负相关。综上,本研究发现PPRV感染山羊PBMCs后,以NF-κB和p38通路依赖途径诱导细胞中miR-3表达,miR-3通过直接靶向负调控IRAK1进而抑制IFN-α的表达,从而促进PPRV在宿主细胞内的复制水平。