基于CRISPR技术衍生出的单碱基基因编辑系统,凭借其特有的碱基替换功能,理论上在不引入DNA双链断裂并且无需同源模板的情况下,完成胞嘧啶C向胸腺嘧啶T的转换。相比于传统的CRISPR/Cas9技术利用同源重组的方式完成单碱基替换,单碱基编辑系统具有操作更简便、适用范围更广泛、碱基替换效率更高、副产物更少等优势。同时,家畜经济性状的改变以及疾病的产生大多数是由单核苷酸变异引起。因此,利用单碱基编辑系统构建大型动物疾病模型和改良动物经济性状具有十分重要的意义。陕北白绒山羊的FGF5基因与毛囊生长发育相关,FGF5蛋白抑制陕北白绒山羊绒毛的生长发育,FGF5基因敲除后可以使陕北白绒山羊绒毛生长速度加快,产绒量大幅度提高。因此,本试验以陕北白绒山羊为试验对象,使用单碱基编辑器(Base Editor 3,BE3)在FGF5基因的第一外显子区域提前引入终止密码子,进而敲除FGF5基因在山羊个体中的功能表达。试验过程及具体结果如下:(1)山羊胎儿成纤维细胞的单碱基编辑器效率验证。在FGF5基因的第一外显子上设计4个sg RNA,并构建相应哺乳动物细胞表达质粒。将sg RNA和BE3质粒按照分组共同转染进入绒山羊胎儿成纤维细胞中,获得了产生单碱基突变的阳性细胞,分别检测4个sg RNA在细胞水平的编辑效率,编辑效率在10%-34%之间。表明设计的sg RNA能够有效靶向山羊胎儿成纤维细胞的FGF5基因。(2)FGF5基因编辑山羊的制备。构建这4个sg RNA的体外表达载体,4个sg RNA和BE3载体通过体外转录获得相应的sg RNA m RNA以及BE3 m RNA。通过同期发情与本交方式获得怀孕供体母羊,5只供体收集一细胞时期胚胎47枚。对胚胎注射BE3m RNA和sg RNA m RNA的混合液,体外培养后,将发育状态良好的22枚胚胎分别移植给7只受体母羊,受孕3只,最终获得5只山羊羔羊,编号分别为:#3、#16、#18、#19、#25。(3)基因编辑山羊编辑效率及脱靶效率检测。经检验发现所有的后代羔羊的FGF5基因均发生了编辑,并且部分位点产生了预期的高效率的点突变。因此,编辑效率为100%。对#16、#25两只基因编辑山羊进行脱靶预测与深度测序分析,在预测的19个脱靶位点中,发现了1处脱靶位点。遗传学分析后,表明该脱靶位点是由BE3系统造成,而非遗传所致。(4)基因编辑山羊的表型分析。采集基因编辑山羊和同龄野生型山羊的臀部皮肤组织,使用苏木精与伊红染色,观察到基因编辑山羊的毛囊数目多于野生型山羊。对比1月龄和2月龄基因编辑山羊与野生型山羊绒毛长度,发现基因编辑山羊的绒毛长度显著长于野生型山羊。转录组测序表明基因编辑山羊和与野生型山羊皮肤中FGF5基因的m RNA表达量基本无差异。使用免疫荧光和蛋白免疫印记杂交分析同月龄基因编辑山羊与野生型山羊臀部皮肤的FGF5蛋白表达情况,基因编辑山羊FGF5蛋白表达量低于野生型山羊。(5)山羊皮肤中癌症相关基因p53基因的检测,使用免疫荧光和蛋白免疫印迹杂交检测皮肤中p53蛋白的表达量,发现基因编辑山羊与野生型山羊之间无差异。表明BE3修饰后的基因编辑山羊与野生型山羊相比没有增加致癌率。综上所述,本研究成功利用单碱基编辑器BE3在基因组上提前引入了终止密码子,制备了FGF5基因敲除的陕北白绒山羊。该试验证明了在大型哺乳动物上使用碱基编辑器具有可行性,这一编辑策略可以简单、快捷地引入点突变并且敲除目的基因。