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第一部分：Kupffer细胞及IL-1β与患者NAFLD进展的关系 目的：比较单纯性脂肪肝（NAFL）与脂肪性肝炎（NASH）患者的临床血清学指标及组织病理学结果，初步探讨Kupffer细胞（KCs）及IL-1β与NASH发生的关系。 方法：根据NAFLD纳入及排除标准，收集高度怀疑或术前影像学诊断为NAFLD患者的肝脏标本，首先制作石蜡切片进行 HE染色，通过NAFLD活动度评分标准将患者分为正常组、NAFL组及NASH组，其次比较各组患者血清转氨酶、甘油三酯、游离脂肪酸（FFA）及IL-1β的水平，最后通过F4/80免疫组化及天狼星红染色法，观察各组肝组织中KCs的聚集情况及胶原纤维的增生情况。 结果： （1）本次共收集8例肝脏标本，经NAS评分诊断NASH3例，NAFL3例，正常肝脏2例。 （2）正常组及NAFL组患者血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、甘油三酯、FFA水平均在正常范围内，血清IL-1β低于检测下限。NASH组患者血清ALT、AST及甘油三脂均在正常参考值范围，FFA及IL-1β水平高于正常组及NAFL组（P<0.05）。 （3）NAFL及NASH肝组织F4/80表达阳性细胞（KCs）较正常肝脏组织明显增多，在肝细胞脂肪变的区域KCs聚集较多；天狼星红染色结果显示NASH组肝组织胶原纤维增生程度较NAFL及正常肝脏组无明显增加。 结论：血清FFA、KCs及促炎因子IL-1β可能参与人体NAFL向NASH的发展。 第二部分：抑制TXNIP与NLRP3基因的表达对Kupffer细胞中NLRP3炎症小体信号通路的影响 目的：观察敲除小鼠硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）基因与NLRP3基因对FFA激活NLRP3炎症小体及促进促炎因子IL-1β分泌的影响，探讨FFA激活NLRP3炎症小体的具体机制。 方法：取野生型（WT）C57BL/6小鼠、NLRP3-/-小鼠及TXNIP-/-小鼠，采用肝脏在体PBS灌注，离体胶原酶消化、梯度离心联合选择性贴壁法分离各组小鼠KCs，F4/80免疫荧光染色及流式细胞技术鉴定KCs的纯度，吞墨实验判断KCs的吞噬功能，光镜下动态观察KCs随时间的形态变化。将分离培养48 h的KCs以2-3×106密度接种于T25细胞培养瓶及激光共聚焦培养皿中，并随机分为2组：①FFA组（FFA Group）：给予浓度为0.3mM的棕榈酸（Palmitic acid,PA）刺激；②对照组(CON Group)：不给予任何刺激。于处理后8h收获细胞。光镜及透射电镜观察KCs的形态变化，荧光实时定量PCR（Q-PCR）检测TXNIP、NLRP3、ASC及Caspase-1 mRNA表达变化，Western blotting检测TXNIP、NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表达水平，激光共聚焦检测TXNIP、NLRP3及Caspase-1的表达情况，ELISA法测定 KCs培养上清液中IL-1β水平。 结果： （1）免疫荧光染色可见KCs细胞膜高表达F4/80分子，提取的KCs纯度大于90％，吞墨实验可见KCs吞噬大量碳素颗粒。 （2）FFA组与CON组KCs光镜下形态无明显差异，透射电镜下可见FFA组KCs吞噬大量脂滴。 （3）WT小鼠FFA组与CON组TXNIP、ASC及 Caspase-1的mRNA表达量无显著性差异（P>0.05），FFA组NLRP3的mRNA表达水平略高于CON组（P<0.05），NLRP3-/-小鼠FFA组TXNIP、ASC及Caspase-1的mRNA表达量高于CON组（P<0.05），TXNIP-/-小鼠FFA组NLRP3、ASC及Caspase-1的mRNA表达量较CON组显著增高（P<0.01）。 （4）WT小鼠FFA组TXNIP、NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白表达量较CON组明显增高（P<0.05），NLRP3-/-小鼠FFA组TXNIP、ASC及Caspase-1的蛋白表达量与CON组相比无显著性差异（P>0.05），TXNIP-/-小鼠FFA组NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白表达量较CON组显著增高（P<0.05）。 （5）激光共聚焦结果示WT小鼠FFA组KCs中TXNIP、NLRP3及Caspase-1的荧光强度较CON组明显增高，TXNIP-/-小鼠FFA组NLRP3及Caspase-1的荧光强度较CON组亦明显升高，NLRP3-/-小鼠FFA组TXNIP及Caspase-1的荧光强度较CON组仅轻度升高。 （6）WT及TXNIP-/-小鼠FFA组细胞培养上清液中IL-1β的水平较CON组明显增高（P<0.05），NLRP3-/-小鼠FFA组IL-1β的水平较CON组仅轻度增高，两组比较无明显差异（P>0.05）。 结论：FFA可激活WT及TXNIP-/-小鼠KCs中NLRP3炎症小体，促进KCs分泌IL-1β，敲除小鼠NLRP3基因后可明显抑制FFA刺激导致的KCs中NLRP3炎症小体的激活及IL-1β的分泌。 第三部分：抑制TXNIP与NLRP3基因的表达对小鼠单纯性脂肪肝及脂肪性肝炎形成的影响 目的：通过建立NAFL与NASH小鼠模型，探讨TXNIP与NLRP3炎症小体在小鼠NAFL与NASH形成过程中的作用。 方法：分别用普通饲料（ND）及蛋氨酸胆碱缺乏的饲料（MCD）饲料喂养WT小鼠、TXNIP-/-小鼠及NLRP3-/-小鼠四周，用高脂饲料（HFD）喂养WT小鼠、TXNIP-/-小鼠及NLRP3-/-小鼠八周。每周称小鼠体重，喂养结束后称肝脏重量，检测小鼠血清中转氨酶、FFA及IL-1β的水平，苏木素伊红染色法（HE染色）及油红染色法观察肝组织病理变化，透射电镜观察WT小鼠肝组织的形态变化，免疫组织化学法观察F4/80在肝组织中的表达情况，激光共聚焦检测肝组织中TXNIP、NLRP3及Caspase-1的表达情况。提取各组小鼠KCs，Western blotting检测TXNIP、NLRP3、ASC及 Caspase-1的蛋白表达水平，免疫共沉淀技术检测 TXNIP、NLRP3、ASC及 Caspase-1的相互作用情况。 结果： （1）WT小鼠、NLRP3-/-小鼠及TXNIP-/-小鼠MCD组血清ALT及AST较ND组明显增高（P<0.05），HFD组较ND组仅轻度增高，无显著性差异（P>0.05）；WT小鼠HFD组与MCD组血清FFA水平较ND组明显增高（P<0.05），NLRP3-/-小鼠与TXNIP-/-小鼠各组血清中FFA水平无显著性差异（P>0.05）；WT小鼠及TXNIP-/-小鼠MCD组血清IL-1β水平明显高于ND组及HFD组（P<0.01），NLRP3-/-小鼠MCD组血清IL-1β水平较ND组及HFD组仅轻度增高，差异亦具有统计学意义（P<0.05）。 （2）WT小鼠及TXNIP-/-小鼠HE染色及油红染色示HFD组NAFL形成，肝细胞有脂肪变，炎症不明显，气球样变少见，MCD组NASH形成，肝细胞有点状坏死，有较多炎症细胞浸润，MCD组肝脏F4/80表达阳性细胞（KCs）较ND组及HFD组明显增多。WT小鼠肝组织透射电镜结果示MCD组肝细胞肿胀，胞浆内有较多脂滴，伴有肝细胞坏死，部分肝血窦被破坏，红细胞进入肝细胞间隙。NLRP3-/-小鼠 HFD组亦有NAFL形成，肝细胞脂肪变，肝血窦压缩变窄，炎症细胞浸润较少，MCD组肝细胞坏死及炎症程度较轻，未形成典型NASH，MCD组肝脏F4/80表达阳性细胞（KCs）与HFD组相比无明显增多。 （3）肝组织激光共聚焦结果示WT小鼠MCD组TXNIP、NLRP3及Caspase-1的表达水平较ND组明显增高，TXNIP-/-小鼠MCD组NLRP3及Caspase-1的表达水平较ND组亦明显增高，NLRP3-/-小鼠MCD组TXNIP及Caspase-1的表达水平较ND组仅轻度增高。 （4）Western blotting结果示WT小鼠及TXNIP-/-小鼠MCD组KCs中NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表达水平较ND组及HFD组明显增高（P<0.05），ND组与HFD组之间无显著性差异（P>0.05）。NLRP3-/-小鼠MCD组ASC及Caspase-1的蛋白表达量与ND组及HFD组相比无显著性差异（P>0.05）。 （5）免疫共沉淀结果示WT小鼠MCD组KCs中NLRP3炎症小体共聚体的量较ND组及HFD组明显增多（P<0.05），ND组及HFD组间无显著性差异（P>0.05），KCs中TXNIP亦可与NLRP3形成共聚体，MCD组TXNIP的表达量较ND组及HFD组仅轻度增加，比较无显著性差异（P>0.05）；TXNIP-/-小鼠MCD组KCs中仍可形成NLRP3炎症小体共聚体，共聚体的量较 ND组明显增多（P<0.05）；NLRP3-/-小鼠MCD组KCs中仍有少量ASC-Caspase-1共聚体形成，共聚体的量较ND组仅轻度增加（P>0.05）。 结论：FFA可通过激活KCs中NLRP3炎症小体，促进KCs分泌IL-1β，诱导WT小鼠NASH形成，敲除小鼠TXNIP基因并不能阻止NASH的形成，敲除小鼠NLRP3基因可明显抑制 KCs中NLRP3炎症小体的激活及IL-1β的分泌，阻止NAFL进展为NASH。