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背景与目的放射基因治疗(radio-genetic therapy)即将具有放射诱导特性的调控序列与肿瘤杀伤基因相耦联,对肿瘤照射的同时诱导目的基因表达,进而达到双重杀伤肿瘤的目的。然而,在常规的放射剂量下,诱导的目的基因表达低且仅限于部分细胞。基因电路(Gene Circuit)是指由特定基因构成的对目的基因具有如物理电路一样信号处理功能的基因亚网络,是近年来肿瘤研究领域的一个新热点。国外研究表明正反馈基因电路对基因表达有放大作用;目的基因在细胞内的同步化表达可进一步增强基因治疗效果。本研究将具有放射诱导性的c-fos启动子与诱生型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase ,iNOS)基因相耦联,构建正反馈基因电路,即在射线作用下诱导iNOS表达,iNOS催化一氧化氮(nitric oxide, NO)合成,后者反过来又激活c-fos启动子,形成正反馈环路,同时由于NO在细胞间的自由扩散,使高表达细胞带动低表达细胞,从而产生基因电路的同步化,最终导致目的基因表达同步、放大;我们还将对该基因电路的同步化放大作用进行验证,分析其动力学特征;进一步利用该基因电路调控自杀基因HSV-TK表达,研究其生物学效应。目的在于探索提高目的基因表达水平、延长表达时间的新途径,从而进一步完善肿瘤放射-基因治疗模式。方法1.构建基因电路表达载体及对照质粒载体:将具有放射诱导性的c-fos启动子与iNOS串联,构建c-fos启动子驱动的iNOS和绿色荧光蛋白(green green fluorescent protein,GFP)双顺反子报告载体pfos-iNOS/GFP;以HSV-TK基因取代报告载体的iNOS,构成对照载体pfos- TK/GFP,以HSV-TK基因取代报告载体的GFP,构成治疗载体pfos-iNOS/TK。基因电路同步放大功能的验证及动力学特征分析:以报告载体和对照载体转染A549细胞,以不同浓度的NO供体SIN-1作用于转染报告载体细胞,检测iNOS表达水平;给以2Gy X-线照射,检测照射后不同时相点GFP、iNOS表达水平和NO产量;利用流式细胞仪观察照射后不同时相点GFP在细胞群体的分布特征。2.该基因电路对TK基因体外表达的调控:以对照载体和治疗载体分别转染A549细胞,检测照射后各时相点HSV-TK表达水平。体外细胞对GCV和放射敏感性分析:MTT法测定经照射和GCV处理后细胞生长抑制率,分析计算GCV半数有效抑制浓度IC50;将转染细胞和未转染的A549细胞分别给予不同剂量的X线照射,绘制细胞辐射剂量-存活曲线,并分析计算D0值及放射增敏比(sensitization enhancement ratio,SER)。TUNEL法检测经照射和(或)GCV治疗后各组细胞凋亡情况。3.体内裸鼠移植瘤实验:用经G418筛选所得的上述阳性转染克隆细胞和未转染的A549细胞接种裸小鼠,给以2GyX射线照射,检测瘤组织HSV-TK表达水平。将由转染对照载体细胞和转染治疗载体细胞成瘤的裸鼠给予GCV治疗、照射+GCV治疗,测算治疗开始后肿瘤体积变化,绘制肿瘤生长曲线。取瘤组织称重、计算抑瘤率。HE染色观察各实验组瘤组织结构,免疫组化检测瘤组织中TK表达。将由阳性转染细胞和未转染得A549细胞成瘤的裸鼠,分别给予不同剂量的X线照射,观测照射后肿瘤体积变化,分析计算TCD50及SER。结果1.经内切酶切和测序鉴定,同步放大基因电路报告载体、治疗载体、对照载体构建成功。转染报告载体、对照载体的细胞照射后GFP较照射前增加;转染报告载体的细胞给以一定浓度的SIN-1作用后,细胞NO的产量和iNOS表达水平在一定范围内随SIN-1浓度的增加而增加。转染报告载体的细胞照射后GFP、iNOS表达随着时间的推移而增加,其中照射后16h, GFP表达较照射前增加增加5.6倍,iNOS增加5.2倍(0.16 vs 0.83)(p<0.01)。对流式结果分析统计得知,照射后16h转染报告载体细胞GFP表达的变异系数(8.4)显著低于转染对照载体的细胞(25.6),表明该基因电路可使目的基因表达的离散程度降低。2.转染对照载体和治疗载体的细胞照射后TK表达均较照射前增加(p<0.05),转染治疗载体的细胞内TK蛋白含量随时间的推移而逐渐增强(p<0.05),其中照射后16h较照射前增加6倍以上(0.134vs0.88)(p<0.01);而转染对照载体的细胞照射后细胞内TK表达无明显差异(p>0.05);照射后16h转染治疗载体的细胞TK表达水平较转染对照载体的细胞增加3.6倍(0.252vs0.88)(p<0.05)。治疗载体组对GCV的敏感性(用IC50表示为0.28μmol/L)比治疗载体组(13.67μmol/L)增加48倍(p<0.01)。给予照射和一定浓度的GCV后,转染pfos-iNOS/TK细胞更易受GCV的诱导发生凋亡(p<0.01)。分析计算得转染pfos-iNOS/TK、pfos-TK/GFP的细胞和未转染的A549三种细胞的Do值分别为1.01Gy、3.46Gy、3.53Gy,根据Do值计算转染治疗载体组和转染对照载体组的SER分别是3.50、1.01,说明该基因电路可使体外细胞对辐射更敏感。3.移植瘤组织中治疗组和对照组HSV-TK表达在照射后均明显高于照射前,其中治疗组增加3倍以上(0.31 vs 0.94),表明所构建同步化基因电路可明显增强体内目的基因表达。肿瘤生长曲线表明,放射合并GCV可明显抑制转染治疗载体的移植瘤,且抑瘤率(96%)明显高于单纯GCV治疗组(75%)和对照载体组(82%)。分析计算得A549/ pfos-TK/GFP组、A549/ pfos-iNOS/TK组、未转染的A549细胞组的TCD50分别是:14.33Gy、6.16Gy、15.6Gy ,根据TCD50计算A549/ pfos-TK/GFP组和A549/ pfos-iNOS/TK组的SER分别是1.09、2.53说明治疗载体组的瘤组织对放射最敏感,同步放大基因电路明显增加了瘤组织对放射的敏感性。免疫组化检测结果表明TK位于转染细胞的胞核内。结论成功构建了放射诱导的NO同步放大基因电路,该基因电路不仅使目的基因的表达水平更加提高,而且使目的基因在转染细胞的表达实现同步化,较好的解决了以前放射-基因治疗中所遇到的基因表达水平低且短暂的问题。由于基因电路可明显增强体内、外环境下HSV-TK的表达水平,因此较显著地提高了肺癌细胞对HSV-TK/GCV系统的敏感性,同时该基因电路具有较强的放射增敏作用。综上,该基因电路明显完善了放射-基因治疗这一新的肿瘤治疗模式,而且对其他基因治疗模式也有一定的借鉴作用。