人脐带间充质干细胞在寡含血小板血浆胶体内的分泌活动研究

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目的:  1.研究人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,HUCMSCs)与寡含血小板血浆(platelet poor plasma,PPP)体外形成胶体的条件以及胶体的性质;  2.将HUCMSCs血浆胶体进行体外培养,从胶体的形态、成分结构和HUCMSCs生物活性上评估其在软组织填充中的作用。  方法:  1、从健康孕妇的剖宫产术中获取脐带,分离出华通胶,用手术刀切成2mm大小块,在培养皿贴壁后加入10%FBS DMEM/F12培养基,1%青霉素-链霉素和重组牛碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF,珠海亿胜),在细胞培养箱进行原代培养1周。在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。待原代HUCMSCs达到80%融合时,按照一定比例进行扩增。第3代HUCMSCs达到80%以上融合时,收集细胞与PPP混匀后形成细胞-血浆混合物,最终细胞浓度5×105/mL作为标准浓度。在六孔板内,吸取细胞-血浆混合物与10%葡萄糖酸钙以不同体积进行混匀,总体积1ml。在细胞培养箱孵育相同时间,记录成胶情况。2、实验组中将HUCMSCs与1ml PPP成胶后进行体外培养,分别在培养后的第1,3,7,14天收集胶体1ml上清液。对照组胶体中没有加入HUCMSCs,只收集第1天上清液最为起始参考值,同时增加二维单层培养的融合度50%的HUCMSCs作为对照。当收集完毕后,对上清液进行酶联免疫吸附实验。将检测的细胞生长因子包括胰岛素样生长因子(IGF-I)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子(TGF-α1和TGF-β1)及血管内皮生长因子(VEGF)。同时胶体在培养后第1周、2周和4周,用4%的多聚甲醛固定,包埋制成石蜡切片,用HE和透明质酸染色检测胶体活性情况。  结果:  1、HUCMSCs与PPP混合物在体外37℃,通过10%葡萄糖酸钙作用凝成胶体,成胶程度与10%葡萄糖酸钙体积比相关,其中最佳比例为混合物:10%葡萄糖酸钙=7:1。所形成的胶体是柔软、半固体和可注射的,在不添加培养基前提下可在培养箱内稳定维持3个月以上。2、体外培养不同时间段,将胶体标本固定、石蜡包埋、切片,通过HE染色、透明质酸染色和ELISA检测上清液中多种细胞生长因子,表明HUCMSCs在胶体支架内三维环境生长,能合成分泌透明质酸和分泌多种促进组织修复再生的细胞生长因子。  结论:  HUCMSCs和PPP可形成一种可塑性较好的胶体,HUCMSCs在胶体内三维环境下分泌多种细胞生长因子,产生透明质酸,增强了胶体在软组织内活性填充修复的作用,可作为一种具有活性的软组织填充材料。
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