[研究目的]：新一代多靶向抗肿瘤药物蛋白酶体抑制剂硼替佐米已被批准用于多发性骨髓瘤和蔓状细胞淋巴瘤的临床治疗,但其在实体瘤的应用尚处临床试验阶段,明确其抗实体瘤的关键生物学机制、建立早期疗效评价指标、早期筛选对治疗有效的患者是治疗成功与否的关键。体外研究发现硼替佐米对乏氧状态下的肿瘤细胞和血管内皮细胞均有较强的选择性细胞毒性作用；临床活检标本发现其显著抑制细胞乏氧应答,降低细胞应对乏氧负荷的能力；血管内皮细胞的损伤可能影响微血管的功能,降低微循环血流,进一步加重肿瘤细胞的损伤。本研究拟1)在组织学水平明确治疗前肿瘤乏氧微环境在硼替佐米治疗肿瘤中的作用以及硼替佐米对肿瘤微循环的影响.2)探讨通过动态增强核磁共振显像监测硼替佐米对肿瘤微循环的影响,进而间接反映硼替佐米抗肿瘤生物学效应的可行性。[研究方法]：应用已建立的含双乏氧应答报告基因--9个乏氧反应元件(hypoxia response element, HRE)驱动的单纯疱疹病毒1胸苷激酶(herpes simplex virus type1thymidine kinase, HSV1-TK)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, eGFP)融合基因的HT29人结直肠癌细胞株(HT29-9HRE-TKeGFP,简称HT29-9HRE)及其移植瘤模型进行如下研究。1)体外实验：验证硼替佐米能够有效抑制HT29-9HRE细胞的乏氧应答。常氧(21%02)/乏氧(0.2%02)条件下培养,同时给予不同药物浓度的硼替佐米治疗,流式细胞仪检测乏氧应答报告基因eGFP的表达,液体闪烁仪测定乏氧应答报告基因TK的功能,蛋白质免疫印迹法检测乏氧诱导因子-1α亚单位(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)及乏氧应答下游产物碳酸酐酶9(carbonic anhydrase9, CA9)的表达,酶联免疫吸附法测定乏氧应答下游产物血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的浓度,每项实验至少重复三次。2)体内实验：在组织学水平明确治疗前肿瘤乏氧微环境在硼替佐米抗肿瘤中的作用及其与乏氧应答抑制之间的关系,以及硼替佐米对肿瘤微循环的作用。右下肢皮下荷HT29-9HRE移植瘤裸鼠随机分为硼替佐米(2mg/kg)治疗组或PBS对照组(8-10只/组)。荷瘤鼠于治疗前2小时、治疗后20小时和治疗后24小时分别被给予外源性乏氧示踪剂pimonidaze、外源性乏氧示踪剂EF5、血流示踪剂Hoechst33342,1分钟后处死。随后即刻取瘤、包理、冰冻、固定、常规/荧光免疫组化染色、显微镜检查,并行以下分析：(?)评价硼替佐米对HT29-9HRE移植瘤的抗肿瘤疗效及其对肿瘤微循环的作用-——定量分析硼替佐米/PBS治疗后24小时,肿瘤整体、肿瘤细胞、肿瘤血管内皮细胞的凋亡标志物cleaved caspase3(CCP3)阳性百分比(即整体凋亡率、肿瘤细胞凋亡率和肿瘤血管内皮细胞凋亡率);定性观察发生凋亡的肿瘤血管内皮细胞所处微血管的组织学形态特征及凋亡对局部微血管功能(即血流灌注)的影响;定量分析硼替佐米治疗后肿瘤血流示踪剂Hoechst33342(?)阳性百分比。(?)分析硼替佐米的抗肿瘤效应与肿瘤局部乏氧微环境和乏氧应答抑制间的关系——将肿瘤大体组织切片显微镜图像划分为一系列1x1mm2的微小区域,依据第一个乏氧示踪剂pimonidazole在各区域内的分布情况,将肿瘤局部微环境的初始乏氧程度分为轻(<10%)、中(>10%)、重(>20%)三度。定性、定量分析不同初始乏氧程度肿瘤微环境内,硼替佐米治疗组和PBS(?)照组的凋亡标记物CCP3(抗肿瘤效应)、内皮细胞标记物CD31(微血管的形态)、血流示踪剂Hoechst33342(微循环功能)、两个乏氧示踪剂pimonidazole和EF5(乏氧的动态变化)、以及乏氧应答下游产物CA9(乏氧应答情况)空间分布的差异。3)动态增强核磁共振显像(Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging, DCE MRI):活体监测硼替佐米治疗后肿瘤血流的动态变化。右季肋部皮下荷HT29-9HRE移植瘤裸鼠,应用自制1H MR螺线圈,行移植瘤局部初始DCE MRI检查,随后随机分为非治疗组、单剂量(2mg/kg)治疗组和双剂量(1.5mg/kg,两次给药间隔24小时)治疗到组(6～8只/组),并分别于初次给药后24小时和48小时再次行移植瘤局部DCE MRI检查,分别评价硼替佐米连续治疗对肿瘤微循环的持续影响,以及单次治疗后肿瘤微循环的动态变化。定性、定量评价指标：获取DCE MRI图像各体素时间-信号强度曲线,应用Hoffman模型拟合计算其幅度A与交换率kep的乘积(简称Akep),间接定量肿瘤组织各体素的血流/灌注量,并生成相应肿瘤层面MR图像的Akep伪彩图,反映肿瘤的血流分布;根据肿瘤全部体素的Akep分布直方图,获取其中位数值(median Akep)代表肿瘤的平均血流量。4)结合离体实验,验证DCE MRI显像结果与硼替佐米抗肿瘤生物学效应间的关系。末次DCE MRI结束2小时后尾静脉注射血流示踪剂Hoechst33342,1(?)钟后处死,随后重复前述组织学实验步骤。定性比较血流示踪剂Hoechst33342显微镜图像与DCE MRI的Akep伪彩图对肿瘤微循环的显示；定性分析硼替佐米治疗后肿瘤微循环和乏氧应答的动态变化；探讨应用DCE MRI显像评价硼替佐米抗肿瘤生物学效应的可行性。[结果]：1)体外实验：证实硼替佐米阻断HIF-1a在HT29-9HRE细胞内的降解,并抑制HIF乏氧应答。经硼替佐米治疗后,有氧和乏氧培养条件下,细胞内的HIF-1α均明显堆积,乏氧状态下更为显著。HIF-1α的堆积却不能启动有效的乏氧应答：乏氧培养的HT29-9HRE细胞乏氧应答报告基因产物eGFP的表达和TK的功能均降至常氧培养水平；乏氧应答下游产物CA9和VEGF的产量也降低至常氧水平。2)体内实验：①硼替佐米治疗后, HT29-9HRE移植瘤的凋亡率显著升高,其中血管内皮细胞的凋亡导致血流灌注量显著降低。治疗组和非治疗组凋亡标记物CCP3阳性百分比分别为5.26%±0.98%和0.58%±0.13%(P<0.001)；其中非治疗组CCP3仅分布在肿瘤细胞内；治疗组3.28%±0.63%的CCP3位于肿瘤血管内皮细胞,1.98%±0.41%(P<0.05)位于肿瘤细胞。凋亡的内皮细胞所处微血管的形态多无明显管腔形成,呈点、条状,几乎无血流灌注;肿瘤的整体血流灌注量也明显降低(对照组和治疗组Hoechst33342的阳性百分比分别为18.72%±2.59%和3.57%±0.83%,P<0.001)。(?)硼替佐米诱导的凋亡与肿瘤微环境的初始乏氧程度、以及乏氧应答的抑制密切相关。对照组移植瘤内几乎无明显凋亡；新生乏氧细胞群体(EF5“+”)的比例与初始乏氧细胞群体(Pimo "+")的比例相似；EF5阳性细胞均有相应的乏氧应答下游产物CA9表达；但CA9的表达能力随初始乏氧程度的加重而逐渐降低：微循环的血流也逐级下降。经硼替佐米治疗后,凋亡主要分布在中重度乏氧区域,cleaved caspase3阳性百分比分别为7.54%±1.31%和7.92%±1.12%,肿瘤细胞和血管内皮细胞均可见明显的凋亡信号,且该区域的乏氧程度明显增加,新旧乏氧肿瘤细胞的保护性乏氧应答产物CA9表达均明显受抑；而在轻度乏氧区域,cleaved caspase3阳性百分比仅为1.08%±0.32%(P<0.001),仅点、条状分布的细小血管见凋亡信号,中间大部分肿瘤细胞均无凋亡启动,肿瘤的乏氧程度无明显增加(无明显的EF5染色),而CA9的表达亦无明显的受损。3)DCE MRI显像能够有效监测硼替佐米治疗后移植瘤微循环的动态变化。硼替佐米单剂量治疗组,肿瘤平均血流量给药后24小时显著降低(以中央部为著),48小时恢复至治疗前水平;肿瘤平均血流(Akep中位值)治疗前、治疗后24小时和48小时分别为0.072±0.017、0.018±0.010(P＜0.05)和0.068±0.018/min:双剂量治疗组,肿瘤平均血流量进行性下降,24小时以中央部血流降低为主,48小时中央部和周边部血流均显著降低。肿瘤平均血流(Akep中位值)治疗前、治疗后24小时和48小时分别为0.072±0.017,0.037±0.013和O.022±0.010,min(P<0.05).4)离体实验证实DCE MRI显像能够间接反映硼替佐米的抗肿瘤生物学效应。血流示踪剂Hoechst33342的分布与末次DCE MRI显像的Akep伪彩图对微循环血流的显示相似：对照组Akep伪彩图和Hoechst33342显微镜图像均显示肿瘤的周边和中央均有一定的微循环血流分布;单次给药后48小时,Akep伪彩图和Hoechst33342显微镜图像均显示肿瘤内的血流分布与对照组相似,肿瘤的周边和中央均见微循环血流灌注,说明此时硼替佐米对肿瘤血流的影响已降低/消失;连续给药后,两种影像均显示仅肿瘤的周边区域有少量微循环血流,中央部几乎无血流灌注,说明随着硼替佐米的连续治疗,肿瘤血流持续降低。硼替佐米治疗后肿瘤微循环的动态变化与其对乏氧应答抑制的动态变化方向一致：单次给药后48小时,随着肿瘤微循环的改善,CA9的表达亦恢复,接近对照组水平;连续给药后肿瘤内的血流灌注进行性降低,CA9的表达亦持续受抑。[结论]：肿瘤微环境的初始乏城程度在硼替佐米抗肿瘤中起决定性作用。乏氧的血管内皮细胞和肿瘤细胞是硼替替佐米诱导凋亡的主要群体,井与硼替佐米阻断乏氧应答密切相关。血管结构不良、处于中重度乏氧状态的肿瘤血管内内皮细胞对硼替佐米更为敏感,易于凋亡,井导致局部微血管关闭、血流降低、进一步加重肿瘤乏氧。DCE MRI(?)够有效监测硼替佐米对肿瘤微循环的影响,籍此可间接反映硼替佐米抗肿瘤的生物学效应。[意义]：本研究揭示了肿瘤乏氧微环境在硼替佐米治疗肿瘤中的重要作用,为充分利用实体肿瘤乏氧的特性、提高硼替佐米的治疗疗效奠定了理论基础;证实了应用DCE MRI可活体、早期、动态监测硼替佐米对肿瘤血流的影响,从而间接反映其抗肿瘤的生物学效应,为早期筛选对硼替佐米治疗有效的患者群体、合理指导硼替佐米联合用药方案的制定提供了有力的临床检测手段。