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绿僵菌（Metarhizium spp.）是一种普遍应用于农业生物防治中的害虫病原菌,同时有抑制植株病原菌、促进植株繁殖的优点。但是现阶段,绿僵菌在农业生物防治中具有杀虫速度慢和抗逆能力差问题。因此,有必要继续探究分析绿僵菌生长发育、抗逆性、致病力的可能作用机制,这将对绿僵菌在生物防治中的广泛应用具有重要意义。泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System,UPS）存在于所有真核细胞中,涉及泛素激活、泛素-底物结合、泛素受体识别和蛋白酶体降解。其中去泛素化酶家族（Deubiquitinating Enzyme,DUBs）是UPS在多个基本细胞过程中的重要组成部分,DUBs分为五大亚家族,其中最大的一类家族是泛素特异性蛋白酶UBPs（Ubiquitin-specific Proteases）。此前研究发现UBPs在丝状真菌发育、生长和抵御外界环境胁迫以及致病性中发挥关键作用,目前去泛素化酶UBP在绿僵菌生长发育、抗逆、致病力和致病中的作用还未有报道。因此,本文以罗伯茨绿僵菌（Metarhizium robertsii）为研究对象,针对去泛素化酶基因MrUbp12（MAA-02151）,探究该基因在罗伯茨绿僵菌生长发育、抗逆性和致病力的作用。主要研究结果总结如下:1.MrUbp12的生物信息学分析根据稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）数据库中去泛素化酶基因Mo Ubp4氨基酸序列进行BLAST比对获得一个氨基酸序列（MAA-02151）,我们将其在罗伯茨绿僵菌中命名为MrUbp12。进一步的序列分析发现绿僵菌去泛素化酶基因MrUbp12具有两个外显子,一个内含子,其开放阅读框（ORF）大小为3,078 bp,编码1025个氨基酸片段;MrUbp12蛋白在C端含有一个保守的UBP12 superfamily（605-839,1.32e-16）功能域。最后通过MrUbp12的氨基酸序列系统发育分析发现罗伯茨绿僵菌与金龟子绿僵菌的遗传距离最近。2.绿僵菌MrUbp12的敲除菌株、互补菌株的获得为了探究MrUbp12在罗伯茨绿僵菌中的生物学功能并验证敲除菌株ΔMrUbp12的生物学表型是由MrUbp12缺失导致的,根据MrUbp12核苷酸序列,构建Ubp12基因敲除质粒及其互补重组质粒,将重组质粒转入农杆菌通过共培养进行遗传转化,达到目的基因敲除和回补。通过GA（草铵膦）和CAS（苯菌灵）抗性筛选再经过PCR和RT-PCR验证后,获得敲除菌株ΔMrUbp12和互补菌株C-ΔMrUbp12。3.MrUbp12在绿僵菌生长发育中的作用分析为了分析MrUbp12对罗伯茨绿僵菌营养生长的影响,菌落形态、颜色和直径分析发现:菌落颜色没有明显差别而菌落形态却有明显差异,敲除菌株ΔMrUbp12菌落生长直径在1/4SDAY和SDAY平板上升了15%和16%。进一步通过萌发速率分析发现:分生孢子萌发提前2 h,萌发中时下降了28%。产孢量分析发现:基因敲除株的产孢量显著下降,第7 d与WT相比较,敲除菌株ΔMrUbp12产孢量下降了97.11%。4.MrUbp12在绿僵菌逆境胁迫耐受力中的作用分析为了研究MrUbp12缺失对罗伯茨绿僵菌逆境胁迫耐受力的影响,（1）将WT、敲除菌株ΔMrUbp12和互补菌株C-ΔMrUbp12分别接种于含有相应浓度的Na Cl、MMS、H2O2和Congo red的PDA胁迫平板中;结果发现:在PDA-Na Cl和PDA-Congo red胁迫平板上菌落生长直径分别上升了33%和20%,同时生长抑制率分别下降了12%和26%;PDA-H2O2和PDA-MMS胁迫平板上菌落生长直径和生长抑制率没有明显差异。（2）抗高温能力测定发现:经42℃热处理后与WT相比较,敲除菌株ΔMrUbp12萌发率上升了38%。（3）抗UV-B能力测定发现:与WT相比较,敲除菌株ΔMrUbp12分生孢子萌发率没有明显区别。5.MrUbp12在绿僵菌致病力中的作用及可能机制分析为了探究MrUbp12参与罗伯茨绿僵菌的致病过程,（1）以大蜡螟幼虫为试虫进行体壁侵染和血腔注射,计算出存活率和LT50;结果发现:与WT和互补菌株C-ΔMrUbp12相对照,敲除菌株ΔMrUbp12的存活率曲线和LT50有显著性差异,敲除菌株ΔMrUbp12 LT50分别推迟了2.2 d和21.34 h。（2）观察分析附着胞形态和附着胞的形成率;结果发现:与WT和互补菌株C-ΔMrUbp12相对照,敲除菌株ΔMrUbp12的附着胞形成率下降了21.79%;附着胞形状长短不同,呈扭曲畸形状。（3）观察分析角质层穿透能力;结果发现:敲除菌株ΔMrUbp12较WT、互补菌株C-ΔMrUbp12的菌落直径下降了26.56%。综上所述,MrUbp12在绿僵菌的生长发育、逆境胁迫耐受力、致病力及致病力可能机制中均发挥重要的作用;结果有利于为利用抗逆、致病力相关功能基因遗传改良菌株、提高真菌制剂的持久性和有效性提供基础。