香菇（Lentinula edodes）是世界重要的食药用菌之一。在我国香菇主要栽培区域,菌棒越夏期间易受高温危害,造成香菇菌棒“烧菌”现象,常给香菇产业造成巨大损失。为了提高香菇产业经济效益,减少菌棒腐烂造成的经济损失,开展香菇耐高温分子机制研究,选育耐高温香菇品种迫在眉睫。热激蛋白DnaJ是生物体内一种重要的环境胁迫响应因子,在动物、植物、酵母的热胁迫响应中具有重要的作用。本实验室前期通过热胁迫前后转录组和蛋白组分析发现,耐热菌株S606热激蛋白LeDnaJ（LE01Gene01273）在转录水平显著上调,热胁迫条件下LeDnaJ07基因上调40多倍,而在热敏感菌株YS3357蛋白水平变化不显著。热激蛋白LeDnaJ07（Le01Gene01273）基因的超量表达可提高香菇菌丝耐热性,并伴随细胞内IAA含量显著提高,LeDnaJ07可能通过与LetrpE相互作用来参与调节香菇IAA生物合成及其对热胁迫的耐受性。但热胁迫下热激蛋白LeDnaJ07如何作用于IAA合成途径而影响菌丝耐热性,其机理尚不清楚。本研究以香菇栽培菌株“武香一号”（W1）为研究材料,通过构建酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid,Y2H）cDNA文库,筛选并鉴定在细胞内与LeDnaJ07互作的蛋白,通过双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation,BiFC）、pull-down 等方法进行蛋白体内及体外互作验证,进一步明确了热激蛋白LeDnaJ07在香菇耐热性中的作用。本研究构建了不同生长阶段和培养基质,以及生物和非生物胁迫下混合酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid,Y2H）cDNA文库,文库3个读码框均大于1.4 x 106cfu,Y187酵母文库浓度大于6.0 x 107cfumL。将LeDnaJ07作为诱饵蛋白,在cDNA文库中筛选与其互作的蛋白。在测序的1000个阳性互作的酵母单菌落中,发现有652个基因序列匹配到香菇基因组上,比对上511个不同基因,其中447个基因有注释信息。通过KEGG富集分析发现,这些基因主要涉及到核糖体通路、氧化磷酸化通路和生热作用通路。并通过GO富集分析发现这些基因主要参代谢过程、细胞定位和细胞转化。根据前期研究,挑选5个蛋自LeYUCCA8、LeALDH7、LeTrpE、LeDnaK和LeKRAS进行Y2H点对点验证及BiFC实验验证。Y2H结果显示LeYUCCA8与LeDnaJ07 Mating后的酵母在SD/-Trp-Leu/X-α-gal培养基上显蓝色,并且在SD/-Trp-Leu-Ura 和 SD/-Trp-Leu-His/3AT（75mM）生长良好,表明 LeDnaJ07 与LeYUCCA8 的互作关系较强,而 LeDnaJ07 与 LeALDH7、LeTrpE、LeDnaK、LeKRAS Mating后的酵母在SD/-Trp-Leu/X-α-gal培养基上显蓝色较浅,并且在SD/-Trp-Leu-Ura 和 SD/-Trp-Leu-His/3AT（50mM）生长稀疏（和弱相互作用的对照相似）,表明 LeDnaJ07 与 LeALDH7、LeTrpE、LeDnaK、LeKRAS 的互作关系较弱。BiFC 结果显示 LeDnaJ07 与 LeYUCCA8、LeALDH7、LeTrpE、LeDnaK、LeKRAS的组合及阳性对照组在烟草细胞内可以看见黄绿色荧光,而阴性对照没有,表明 LeDnaJ07 与 LeYUCCA8、LeALDH7、LeTrpE、LeDnaK、LeKRAS 存在互作关系。采用体外蛋白Pull-down对LeYUCCA8与LeDnaJ07的互作关系进行验证,结果表明MBP-LeYUCCA8能够将LeDnaJ07结合到吸附柱上,而阴性对照则没有,进一步验证LeYUCCA8与LeDnaJ07存在互作关系。本研究构建了香菇栽培菌株W-1在不同处理条件下的混合酵母双杂交cDNA文库,通过文库筛选获得大量与LeDnaJ07互作的蛋白,并对部分互作蛋白进行验证。本研究系统地研究了香菇酵母双杂交cDNA文库构建的方法,并筛选了与LeDnaJ07互作的蛋白,不仅为研究香菇在不同生长时期、不同培养基质、生物和非生物胁迫下的蛋白互作奠定了基础,对其他真菌的体内体外蛋白互作试验也具有参考价值,而且为揭示热胁迫下LeDnaJ07维持IAA合成和热信号传导的方式,明确LeDnaJ07影响香菇菌丝耐热性的分子机制奠定了坚实基础。