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水稻作为全球重要的粮食作物,每年因病害流行而造成减产,威胁着世界粮食安全。面对病原物的入侵,植物衍生出自己的免疫机制。在诸多的抗病反应中,所有的信号传导、基因表达及调控最终都需要通过转录因子实现。因此解析水稻抗病相关转录因子,对研究水稻抗病机制十分重要。新一代基因组编辑技术CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated Protein）自问世以来迅猛发展,在生命科学各领域掀起了技术革命,并被广泛应用于作物遗传改良中。利用CRISPR技术对水稻抗病抗逆相关基因以及产量相关基因进行修饰,以增强水稻对生物和非生物胁迫的抗性提高水稻产量成为当前水稻分子育种的重要研究内容。随着水稻等植物基因组序列及基因功能被解码,由病诱导表达基因的启动子出发,寻找与其互作的转录调控因子,有助于解析水稻抗病调控网络,可以为基因编辑提供有价值的靶位点,具有重要意义。但目前在植物中通过感兴趣的启动子来筛选鉴定它的转录因子仍是一大技术难题。为了研究水稻抗病相关基因的转录调控机制,本研究从已知的受病原诱导表达的基因出发,在水稻中建立了基于CRISPR/Cas9的载体,用于筛选、鉴定转录因子。包括从植物体内通过免疫共沉淀（immunoprecipitation,IP）分离兴趣基因组区段及其互作复合体的 CRISPR-IP（Targeted purification of Cas9-DNA-TF complex using IP）方法,以及利用邻近标记（proximity labeling,PL）从体内亲和纯化和目标启动子结合蛋白的 CRISPR-PL（Targeted labeling TF using Cas9 mediated proximity labeling）方法。取得的主要结果如下:1.为了在水稻中建立CRISPR-IP方法,我们设计了一个dCas9-T2A-BirA融合基因来同时表达dCas9和生物素连接酶BirA两个蛋白,其中dCas9含有BirA的生物素化修饰氨基酸位点,用于通过IP靶向捕获dCas9结合的染色质片段。本研究共构建CRISPR-IP载体7个,其中的dCas9/gRNA分别靶向水稻MPK5、MPK2和PR5启动子。通过在原生质体中表达CRISPR-IP载体,我们检测到成熟的dCas9和BirA蛋白,以及被生物素化标记的dCas9蛋白。载体中使用的T2A肽在水稻原生质体中的自剪切效率接近100%,可以实现由一个融合基因dCas9-T2A-BirA同时表达dCas9和BirA两个蛋白的预期目标。由于BirA的标记底物是生物素,我们在原生质体中证明了生物素处理对水稻细胞活性无影响。此外我们构建了载体pDPID0-3D表达dCas9-GFP融合蛋白,在原生质体中证明了生物素化不影响dCas9的定位。目前我们已经获得了 5个CRISPR-IP载体的T1代、T2代和T3代稳定转化水稻植株。我们分别在T0代和T1代转基因水稻中验证了 dCas9蛋白表达和生物素化修饰,为下一步使用链霉亲和素靶向纯化dCas9结合的染色质片段提供了基础。2.我们通过将失活核酸酶（dCas9/dxCas9 3.7）与具邻近标记功能的生物素连接酶（BirA*/BASU/APEX2）融合表达,在水稻中建立CRISPR-PL方法。其原理为gRNA引导融合蛋白靶向目标启动子,生物素连接酶生物素化标记被靶向序列空间范围内邻近的蛋白,通过链霉亲和素直接纯化被标记的邻近蛋白和潜在的互作蛋白。由于CRISPR-PL方法在一定程度上受限于PAM,我们通过定点突变获得了 dxCas9 3.7构建了识别NG-PAM的CRISPR-PL载体;并且由于不同的生物素连接酶有不同的标记效果,因此选择了三种具邻近标记功能的生物素连接酶（BirA*/BASU/APEX2）用于构建CRISPR-PL载体。共构建了五类不同的CRISPR-PL 载体,命名为 pDPID1、pXDPID1、pBUID、pXBUID 和 pAPID,分别表达 dCas9-BirA*、dCas9 3.7-BirA*、dCas9-BASU、dxCas9 3.7-BASU和dCas9-APEX2融合蛋白。本研究共构建CRISPR-PL载体26个,其中gRNA引导CRISPR-PL融合蛋白分别靶向水稻MPK5、MPK2和PR5启动子。我们在原生质体中验证了以上五类CRISPR-PL载体,检测到失活核酸酶-生物素连接酶融合蛋白,以及被生物素化标记的融合蛋白。已经获得14个CRISPR-PL载体的T1代和T2代转基因水稻。并在pAPID稳定转化的水稻材料中验证了 dCas9-APEX2融合蛋白,为后续利用CRISPR-PL方法直接纯化邻近蛋白提供基础。综上所述,本研究基于CRISPR技术,构建了 CRISPR-IP和CRISPR-PL的载体,用于分离、鉴定与目标启动子结合的转录调控因子。我们己经获得了充足的稳定转化水稻材料,为接下来解析水稻抗病信号通路中MPK2、MPK5和PR5的转录调控机制提供基础。