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变应性鼻炎(Allergic Rhinitis,AR)是指特应性个体暴露于吸入性变应原后主要由Ig E介导的递质释放、并有多种免疫活性细胞和细胞因子参与的鼻黏膜非感染性炎症疾病。目前,AR发病机制以Th1/Th2失平衡,围绕Th2方向的免疫应答为特征,其中鼻黏膜上皮细胞作为变应原致敏的第一站,免疫学活性受到越来越多的关注。现有研究结果显示,鼻黏膜上皮(Nasal epithelial cells,NECs)通过细胞连接及产生功能性细胞因子调控天然免疫和获得性免疫,是启动并维持气道炎症性疾病如AR、哮喘的关键。NECs接触变应原后免疫活性延长和/或增强产生多种促炎因子,生长因子及趋化因子经树突状细胞(Dendritic cells,DCs)启动下游Th2方向的免疫应答,随后,T细胞经细胞因子再次诱导上皮细胞的免疫活性,级联放大下游免疫反应,并诱导嗜酸性粒细胞,嗜碱性粒细胞及其它炎性细胞的免疫应答。目前,以鼻黏膜上皮细胞为中心的研究多集中在鼻黏膜上皮细胞免疫活性本身,或鼻黏膜上皮细胞与树突状细胞(DCs)信息传递参与变应性疾病发病的具体途径的上。近年,诱导调节性T细胞(Regulatory T Lymphocytes,Tregs)对吸入性变应原发生免疫耐受来治疗变应性疾病的思路被认可,并已通过大量体内、体外实验证实CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞可以抑制Th2方向的变态反应并且在变应原特异性免疫治疗的免疫学机制中起主要作用。它主要通过抑制DCs的成熟并诱导产生效应性T淋巴细胞,抑制B淋巴细胞变应原特异性Ig E的产生并增加Ig G4和/或Ig A的表达,还能够抑制肥大细胞(Mast cell)、嗜酸性粒细胞(Eosinophils)、嗜碱性粒细胞(Basophils)在变应性疾病中的免疫学活性,从而达到免疫耐受,缓解或治疗变应性疾病。另外,Treg细胞与局部组织重塑也有显著相关性,并具有抑制效应性T淋巴细胞向局部组织迁移发生免疫应答等的生物学特性。这些对变态反应的抑制性特征使Treg细胞在AR或哮喘的研究中受到高度重视。而这种抑制性的免疫学活性的发挥依赖于细胞连接如CD25、CTLA-4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen)、ICOS(Inducible costimulatory molecule)及细胞因子IL-10、TGF-beta、IL-4、PD1(Program death-1)等的释放。同时,Treg细胞的相关研究进展给治疗变应性疾病提供了新思路,却也仍然存在诸多困惑。例如至今尚未发现天然的变应原特异性CD4+CD25+Treg细胞存在,且尚未寻找到安全有效的增活剂。直接用已知的Tregs敏感的功能性细胞因子如TGF-beta或IL-10对Treg细胞进行诱导并不可行,前者有致癌作用且具有较强诱导纤维化的缺点;IL-10免疫活性仍然不确定且体内半衰期过短。因此,目前对Treg细胞免疫耐受的机制研究迫切需要有进一步的探索。Ngugen等2010年的研究结果表面哮喘患者下呼吸道上皮细胞来源的TSLP能够抑制Treg细胞功能活性,Treg细胞表面能够表达TSLP受体,下气道上皮细胞与Treg细胞通过TSLP/TSLPR进行直接的信号联系且参与了哮喘的发病机制。而我们不难发现TSLP也是鼻黏膜上皮细胞参与AR发病的重要的细胞因子之一,然而,变应性鼻炎的鼻黏膜上皮细胞是否能够对Treg进行免疫调控尚不清楚,了解二者之间是否存在AR相关的细胞通讯有助于找出诱导Treg细胞免疫耐受的机制中治疗AR的新靶点。因此,我们提出了本课题的科学问题或假说,鼻黏膜上皮细胞与CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞之间存在直接的信息传递机制;二者的细胞间信息传递可能参与AR发病机制。围绕这一假说,本课题的研究主要分三部分进行。第一部分:为了探讨鼻黏膜上皮细胞与Treg细胞之间是否直接存在直接的信息传递,建立鼻黏膜上皮细胞-CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞体外共培养模型。采集健康志愿者鼻黏膜上皮细胞,进行人类原代鼻黏膜上皮细胞体外培养至细胞融合,免疫磁珠分离健康志愿者人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)来源的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞,建立NECs-Tregs共培养模型。流式细胞术检测共培养后与单独培养的Treg细胞的细胞表面标志的表达,探讨与单独培养的Tregs相比较共培养后Treg细胞抑制性活性的细胞表面标志CCR8、CTLA-4表达增高(p=0.002,P<0.05;p=0.035,P<0.05)的意义。第二部分:筛选并探讨AR鼻黏膜上皮细胞暴露于特异性变应原后可能与Treg相关的细胞因子的表达水平的变化及意义。采集血清特异性尘螨Ig E阳性的变应性鼻炎患者及健康志愿者鼻黏膜上皮细胞体外培养。RT-PCR检测经特异性变应原重组蛋白片段Der p1刺激后AR组与对照组可能与Treg相关的细胞因子的m RNA的表达水平,主要包括TSLP,IL-10,TGF-β,IL-25,CCL1;ELISA检测细胞悬液中的蛋白浓度。分别探讨AR组经Derp1刺激后与健康对照组及空白对照组相比较TSLP表达增高(P<0.05)、CCL1表达降低(P<0.05)、IL-25m RNA及TGF-βm RNA表达增高(P<0.05;P<0.05)的意义。第三部分:为探讨AR发病机制中鼻黏膜上皮细胞对Treg细胞抑制性作用的调控方向及可能的信息传递途径。利用第一部分建立的共培养模型,于共培养后流式细胞术检测Treg细胞表面标志的表达,探讨与对照组相比AR组Foxp3+Treg细胞表面标志CCR8、CTLA-4表达下降(p=0.007,P<0.05;p=0.011,P<0.05)的意义。ELISA检测并探讨共培养后细胞悬液中AR组与健康对照组相比TSLP增高(p=0.016,P<0.05),CCL1降低(p=0.047,P<0.05),而IL-10(p=0.101,P>0.05),TGF-β(p=0.432,P>0.05)蛋白质浓度无统计学差异的意义。分析并探讨共培养后鼻黏膜上皮细胞来源的细胞因子及Foxp3+Treg细胞表面标志中TSLP/CTLA4(P>0.05)、CCL1/CCR8(r=0.642,p=0.01,P<0.05)、TSLP/CCR8(P>0.05)、CCL1/CTLA4(P>0.05)的相关性及在变应性鼻炎发病机制中的意义。本课题的研究结果提示我们,鼻黏膜上皮细胞与CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞存在直接的细胞通讯;NECs-Treg共培养后Treg细胞的抑制性活性增强;而在AR患者接触特异性变应原后,鼻黏膜上皮细胞的免疫学活性的异常使CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的抑制性作用下降,而这种负向调控作用可能参与了AR的发病机制。本研究中,变应性鼻炎鼻黏膜上皮细胞经特异性变应原重组蛋白Derp 1刺激后的免疫学活性异常包括TSLP表达增高(m RNA及蛋白浓度),CCL1表达下降(m RNA及蛋白浓度),IL-25m RNA表达增高,TGF-βm RNA表达增高;Foxp3+Treg细胞的抑制性作用的减弱主要包括共培养后AR组Treg细胞表面标志CTLA-4降低,CCR8降低。体外实验中,AR鼻黏膜上皮细胞CCR8特异性配体的CCL1降低,与共培养后Treg细胞CCR8降低有显著相关性,因而,CCL1/CCR8途径可能是鼻黏膜上皮细胞-CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的信息传递途径之一,该途径的功能异常可能参与AR的发病。该结果进一步为鼻黏膜上皮细胞的免疫学活性在变应性鼻炎发病机制中的重要作用提供佐证,为经鼻黏膜上皮诱导免疫耐受治疗AR提供理论依据;为AR乃至上、下呼吸道变应性疾病的治疗提供新思路。