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卵巨球蛋白是鸡蛋清中的一种糖蛋白,含量为蛋清蛋白质的0.5%,具有多种生物活性。目前,国内尚未开展卵巨球蛋白的研究,鉴于此,本课题对卵巨球蛋白及其它蛋清蛋白质快速、高效制备的基础之上,解析卵巨球蛋白的糖基化结构,研究其与金属离子之间相互作用和调控成纤维细胞迁移的特性,为卵巨球蛋白的研究和应用及其生物活性作用机制的阐明提供基础。主要研究进展如下:（1）研究了聚乙二醇沉淀法对蛋清蛋白质的分离效果,建立了蛋清主要蛋白质的联合纯化方法。鸡蛋清经稀释、调节pH后,采用聚乙二醇分级沉淀分为4个组分;沉淀A经氯化钠溶液处理,获得卵粘蛋白;沉淀B、沉淀C和上清D经阴离子交换层析分离,获得溶菌酶、卵转铁蛋白、卵白蛋白和卵黄素蛋白。卵粘蛋白、溶菌酶、卵转铁蛋白、卵白蛋白和卵黄素蛋白纯度分别可达到82.4%、91.8%、94.6%、96.5%和88.2%,提取率分别为63.6%、30.1%、77.8%、88.6%和53.2%。溶菌酶活力为18500 U/mg,卵转铁蛋白和卵黄素蛋白均保持了活性。该方法操作简便、快捷,具有规模化应用的潜力,为蛋清蛋白质的应用提供了良好的技术基础。（2）通过聚乙二醇分级沉淀浓度的优化、层析类型的选择和层析流程的改进,建立了两步层析纯化卵巨球蛋白的方法。聚乙二醇分级沉淀获得富含卵巨球蛋白蛋清组分后,采用离子交换层析和凝胶过滤层析纯化。聚乙二醇分级沉淀浓度为4-8%;阴离子交换层析洗脱流速为2.5 mL/min,洗脱液氯化钠浓度为0.18 mol/L;目标收集液经超滤浓缩后,凝胶过滤层析纯化,进样量为5 mL,洗脱流速为1.0 mL/min。得到的卵巨球蛋白在SDS-PAGE电泳凝胶上为单一条带。样品经质谱被鉴定为“gi|45382565|ovostatin（Gallus gallus）”,即鸡卵巨球蛋白。该方法减少了层析步骤,缩短了纯化周期1/3以上,提取率由17%提高至37.8%,提高约120%。（3）对卵巨球蛋白纯化过程中分离参数进行改进和优化。使用5-9%的聚乙二醇对鸡蛋清溶液沉淀,获得的组分通过凝胶过滤层析纯化,洗脱液为磷酸盐缓冲液（PBS,pH 7.4）,流速为0.75 mL/min,进样量为3.0 mL。HPLC测定最终样品纯度为97.0%。经电泳分析,卵巨球蛋白保持了抑制胶原酶的活性。原子力显微镜分析结果表明,卵巨球蛋白分子在固-气界面上为圆盘状,直径38.0±4.0 nm,高度2.7±0.5 nm,分子形态完整。一步层析法仅需一种层析填料,降低了制备成本,操作简便,可在10-12 h内获得纯化的卵巨球蛋白,提取率高达62.5%,对卵巨球蛋白的研究和应用开发具有重要的意义。（4）采用质谱和二维电泳技术对卵巨球蛋白的糖基化结构进行了解析。MALDI-TOF-MS测定卵巨球蛋白亚基分子量为183.3 kDa,糖链部分的分子量为21.1kDa,占11.5%。将卵巨球蛋白去糖基化处理和酶解,HPLC-ESI-MS/MS对其N-糖基化位点进行鉴定,发现了11个位点发生了糖基化,另一个位点（N1221）表现为糖基化和未糖基化两种形式。通过与其他鸟类巨球蛋白的对比,发现了鸡卵巨球蛋白N-糖基化位点的丢失现象。二维电泳结果显示,卵巨球蛋白在170 kDa附近表现为一系列横向分布的蛋白点,等电点范围为5.03-6.03,显现出显著的不均一性。研究结果为卵巨球蛋白分子结构和生物活性的研究提供了重要信息。（5）研究了卵巨球蛋白与部分金属离子相互作用的特性。荧光光谱分析发现,Zn2+对卵巨球蛋白的荧光具有增强作用,但速率常数为6.22×109 L/（mol?s）,未发生稳定结合;Cu2+和Fe3+对卵巨球蛋白的荧光具有猝灭作用,猝灭速率常数分别为4.13×1011 L/（mol?s）和1.16×1012 L/（mol?s）,为静态猝灭,表明发生了较为稳定的结合,结合常数分别为5.27×102 L/mol、9.57×105 L/mol,结合位点数分别为0.8、1.2。同步荧光光谱结果表明,Cu2+使其色氨酸残基最大发射波长发生红移。CD光谱和傅FT-IR光谱研究发现,Cu2+、Fe3+使卵巨球蛋白的β-折叠结构减少,无序结构增加。根据研究结果,提出卵巨球蛋白除通过“诱捕”作用抑制金属蛋白酶外,还可与金属蛋白酶竞争性地结合金属离子,实现对金属蛋白酶更强的抑制。（6）研究了卵巨球蛋白对成纤维细胞迁移的促进作用。以小鼠胚胎成纤维细胞（3T6）和人皮肤原代成纤维细胞（HSF）为模型,结果显示,卵巨球蛋白对3T6细胞的生长数目、细胞活力和细胞增殖周期均无显著的影响,同时对生长因子FGF、TGF-β无显著的调控作用,表明其对细胞增殖无调控作用。划痕实验和粘附实验表明,200 nmol/L卵巨球蛋白可使3T6细胞和HSF细胞的迁移速度分别提高25%和28%,使HSF细胞的粘附率提高78%;同时,卵巨球蛋白可上调β1-整合素（β1-integrin）、β-微管蛋白（β-tubulin）和β-肌动蛋白（β-actin）的表达,下调E型钙粘素（E-cadherin）的表达。据此,提出卵巨球蛋白可通过增强细胞与细胞外基质的粘附、降低细胞与细胞之间的聚集、加强细胞骨架,进而实现对细胞迁移的促进。