必特螺旋霉素(Bitespiramycin,BT)是由Streptoymyces spiramyceticus WSJ-195生产一种新型开发的多组分十六元大环内酯类抗生素,是中国新药开发项目用于临床抗菌的国内首个一类新药。该药在Ⅱ期和Ⅲ期临床试验中证明有卓越的治疗效果。然而必特螺旋霉素的发酵效价低一直是阻碍其大规模应用的原因之一。本课题针对必特螺旋霉素发酵效价低,异戊酰螺旋霉素Ⅲ组分和总异戊酰螺旋霉素含量不高等问题,通过前体物质外源添加和链霉菌信号分子类似物外源添加来研究其对必特螺旋霉素合成的影响,并从关键酶活性、胞内代谢物图谱和代谢通量分布的角度对γ-丁内酯A因子类似物1,4-丁内酯提高必特螺旋霉素产量的原因进行详细的解析。首先,通过对现有必特螺旋霉素化学效价测定方法的改进,建立了适用于高通量检测的,更为高效快速的方法。相比于常规法,此方法具有更高的线性和测定平行性,其标准曲线相关系数达到0.999以上。此外,根据产物必特螺旋霉素的生物抗菌性,建立了基于枯草芽孢杆菌的生物效价检测体系,其标准曲线相关系数也达到0.99以上。比较常规法化学效价检测结果和高通量法化学效价检测结果,发现虽然高通量法化学效价结果低于常规法化学效价结果,但是两者整体变化趋势一致。由于必特螺旋霉素组分多而复杂,因此后续实验采用生物效价,辅以高通量法化学效价来客观、真实地反映产物的产量和质量。其次,通过考察常规三碳化合物(正丙醇、丙三醇、乳酸盐和丙酸盐)的外源添加对必特螺旋霉素合成的影响,发现添加3 g/L正丙醇时,可以提高必特螺旋霉素生物效价8%,但是正丙醇的加入不利于异戊酰螺旋霉素Ⅲ组分和总异戊酰螺旋霉素的合成。相比之下,9 g/L丙三醇不但能够提高8%必特螺旋霉素生物效价,还能提高3%异戊酰螺旋霉素Ⅲ组分含量和4%总异戊酰螺旋霉素含量。至于乳酸盐,实验结果表明其添加效果不明显,必特螺旋霉素生物效价以及异戊酰螺旋霉素Ⅲ组分和总异戊酰组分含量基本未有增加。在发酵18 h后添加0.4 g/L丙酸钠,其对产物必特螺旋霉素的促进效果最佳,虽然生物效价和总异戊酰组分含量基本不变,但是异戊酰螺旋霉素Ⅲ的组分含量升高30%。再次,通过发酵12 h外源添加1 mM的廉价A因子类似物1,4-丁内酯,发现发酵结束时必特螺旋霉素生物效价能提高20%以上,但是异戊酰螺旋霉素Ⅲ组分和总异戊酰组分含量相差不大。针对这一结果,后续组合考察了 12 h外源添加1mM的1,4-丁内酯,18 h后添加0.4 g/L丙酸钠的组合策略,但是结果并未如期待的那样既增加必特螺旋霉素生物效价的同时,又提高异戊酰螺旋霉素瓜组分含量。组合策略下,虽然异戊酰螺旋霉素Ⅲ组分含量有所提升,但是必特螺旋霉素生物效价出现明显下降,这表明1,4-丁内酯和丙酸钠对于细胞促进作用并不能协同。最后,通过对糖酵解途径关键酶丙酮酸激酶、TCA循环关键酶柠檬酸合酶和回补途径关键酶丙酮酸羧化酶活性的检测,结合胞内代谢物图谱以及胞内代谢通量的分析,对1,4-丁内酯促进必特螺旋霉素生物效价的作用机制进行了详细研究。糖酵解关键酶PK活性在发酵前期添加1,4-丁内酯的组别中会明显高于未添加组别,同时胞内代谢物图谱分析的结果也从侧面证实了这一点,添加1,4-丁内酯后糖酵解上游途径的中间代谢物和PPP途径的中间代谢物其胞内含量都要显著高于未添加组别,而糖酵解下游途径的中间代谢物要低于未添加组别。这些结果表明PK活性的增强会增加糖酵解途径的通量。TCA循环中的关键酶CS活性则明显低于未添加组别,这与TCA循环中间代谢物浓度要低于未添加组别的结果也相一致,同时回补途径关键酶PC的活性也一直低于未添加组别,进一步说明TCA循环的减弱,以及丙酮酸更多的代谢为乙酰辅酶A进入产物合成的途径。另一方面,在产物快速合成期,胞内代谢通量计算结果指出,此时糖酵解和PPP途径会有所增强,同时必特螺旋霉素大环合成的直接前体物质,尤其是18 h甲基丙二酰辅酶A和丙二酰辅酶A的合成量分别是对照的2.28和1.73倍。但是TCA循环有所减弱。因此,加1,4-BL后提高必特螺旋霉素生物效价的原因是调节TCA代谢通量,更多的乙酰辅酶A合成必特螺旋霉素生产所需的前体物质,另外糖酵解和PPP途径的通量增加,为产物的合成提供了充足的辅酶A类物质和NADPH。本文研究将为后续工业规模应用前体添加策略和链霉菌信号分子类似物添加策略提供理论和技术依据。