造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)具有自我更新和多向分化的潜能，其通过自我更新维持干细胞数量的恒定，保证整个造血系统功能的正常行使。HSC自我更新能力的异常与白血病和骨髓衰竭综合征等临床血液疾病的发生发展密切相关。越来越多的证据表明，调控HSC自我更新的关键基因和信号通路往往在胚胎期造血发育过程中至关重要。因此我们希望从发育的角度研究HSC的调控机制，借此加深对造血发育过程的理解，同时也为血液疾病的发病机理解析和治疗提供理论基础。　　斑马鱼是研究脊椎动物造血发育过程的独特模式生物，并特别适用于大规模的前向遗传学筛选和化学药物筛选。同时，参与斑马鱼造血发育过程的关键解剖器官和重要转录因子都和哺乳动物高度保守。斑马鱼的造血发育过程分为原始造血和定向造血。HSC产生于定向造血过程，由背部主动脉腹侧壁的内皮细胞特化形成。新生的HSC在胚胎受精后2天(2 days post fertilization，dpf)迁移到尾部造血组织（caudal hematopoietic tissue，CHT，类似于哺乳动物胎肝）;随后，一部分HSC在3dpf迁移到胸腺，大部分则在5dpf归巢到肾髓以维持成体造血。　　我们利用斑马鱼为模式生物，以造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell，HSPC)的标志基因c-myb在5dpf的全胚胎原位杂交结果作为筛选标准，通过化学诱变剂乙基亚硝基脲（N-ethyl-N-nitrosourea，ENU）介导的大规模前向遗传学筛选策略，筛选影响HSC自我更新和迁移的突变家系。最终获得可遗传的236对突变株，并根据c-myb在CHT、胸腺及肾髓的染色情况将其分为四类，分别是三者均无染色（112对）、染色减弱（89对）、染色增加（33对）及迁移异常（c-myb染色分布异常，2对）。　　在定向造血发育过程中，迁移到胎肝/CHT的HSPCs会进入活跃的细胞周期，进行大量增殖。在DNA复制过程中，大量有害的DNA损伤或者DNA复制压力会破坏基因组的稳定性，影响HSPCs的存活。因此，机体需要具备一套完整的DNA损伤应答(DNA damage response，DDR)机制来识别并修复DNA损伤。有关DDR和DNA复制在造血发育过程中的重要作用及分子调控机制有待进一步探究。　　cas003是我们筛选得到的一个突变株，它存在因HSPCs缺陷引起的严重定向造血异常。长时程的分析发现cas003突变体里HSPCs的减少开始于CHT增殖阶段，而不是特化产生阶段。细胞学上的分析揭示HSPCs的减少是由于其发生了p53依赖的细胞凋亡。通过定位克隆分析，我们发现cas003突变体的造血异常是由于topbp1基因上一个无义突变导致，并通过topbp1敲降/敲除模拟表型、topbp1过表达恢复表型等实验证实了这一点。深入研究发现TopBP1的无义突变导致其缺失C端的核定位信号，从而使其错误地从细胞核内定位到胞浆中，无法在有DNA复制压力存在的情况下正常激活ATR-Chk1这个重要的DNA损伤应答信号通路，进而导致HSPCs里DNA损伤的大量积累，最终导致造血衰竭。同时我们也发现topbp1 cas003突变体及其HSPCs对羟基脲（一种模拟DNA复制压力的化合物）异常敏感。综上所述，我们揭示了TopBP1及DNA损伤应答通路在造血发育过程维持造血干细胞基因组的完整性、稳定性以及其存活的重要性。　　通过对另外一个突变体LDD792的初步研究，我们发现该突变体和cas003一样有明显的因定向造血干细胞减少引起的定向造血异常，而且其HSC的减少也开始于CHT的快速扩增过程。定位克隆和mRNA恢复实验证明该突变体是由于recql4的无义突变引起。通过蛋白结构域分析，我们发现该无义突变会导致RecQL4缺失其关键的解旋酶结构域。这些结果提示在DNA复制及DNA损伤应答过程中发挥重要作用的RecQL4对早期CHT(胎肝)造血过程不可或缺。　　通过以上研究，揭示DNA损伤应答和DNA复制在早期造血发育中对HSPCs的存活和增殖至关重要，为揭示骨髓衰竭综合征的致病机制提供线索，而且这些突变株可以作为疾病模型进行化学药物筛选，对血液疾病的治疗具有重大意义。