应用ClinProt技术筛查正常人和不同证型银屑病患者的相关蛋白

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目的:本研究主要应用ClinProt技术联合MALDI一TOF技术,检测正常人和不同中医证型银屑病患者血浆及血T淋巴细胞膜上的相关蛋白,试图找出不同中医证型银屑病患者与健康人之间的差异表达蛋白,并从纵向水平上把T淋巴细胞膜上的受体蛋白和血浆的配体蛋白联系起来,揭示中医证候的科学内涵,从整体水平评价“证”的实质,并为中医辨证论治提供物质基础,取得中医现代化的新突破。方法:一、研究对象:(一)寻常型银屑病患者组确诊为寻常型银屑病的患者共30例,按照纳入标准的中医辨证分型分为血热证、血瘀证、血燥证,各10例。(二)正常对照组选取10例在年龄、性别与银屑病组相匹配的健康人作为正常对照组。二、实验方法:(一)获取血浆和T淋巴细胞膜蛋白:1.血浆:抽取肘静脉血10ml于含有肝素的抗凝管中,摇匀,离心,取上层血浆1ml置-20℃下保存。2.T淋巴细胞膜蛋白:(1)外周血T淋巴细胞余静脉血摇匀后加入等量的磷酸盐酸缓冲液(PBS)缓冲液混匀,按人淋巴细胞分离液的说明书操作,提取外周血单个核细胞,注意予PBS溶液重复洗涤,以充分去除血小板等杂质;(2)免疫磁珠法分离出血T淋巴细胞,按试剂盒要求的操作流程进行:①样品制备②磁标记③用LS柱子进行磁珠分选;(3)按T淋巴细胞膜蛋白试剂盒要求加入匀浆缓冲液及酶蛋白抑制剂,反复研磨细胞,直至显微镜下观察细胞裂解70%以上,通过梯度离心得到T淋巴细胞膜蛋白。(二)建立血浆、T淋巴细胞膜差异蛋白图谱:1.蛋白样品制备和定量。2.按照试剂盒说明制备样品、标准品、基质。3.将样品、标准品分别和基质混合制成结晶。4.将结晶放入质谱仪进行质谱分析,采集图谱。(三)统计学处理:数据采集flexcontrol3.3.85.0,线性模式:LP-cl inprot,电压25kv,利用标准品CPS校正系统,测量范围0-lOKd,激光频率100Hz,强度40-60,激发1000次,标峰软件flexanalysis3.3.65.0。把分组样本图谱导入统计分析软件ClinProTools2.2,进行峰统计分析,选择差异峰的标准是P<0.05,ratio>1.5。结果:本实验采集了银屑病膜蛋白的低分子量范围内的蛋白峰图谱,发现与健康对照组相比,银屑病血热组有1个表达上调的差异蛋白峰(4747Da);血瘀组有1个表达上调、2个表达下调的差异蛋白峰(4747Da、2068Da、7764Da);血燥组有1个表达上调的差异蛋白峰(4747Da)。它们均有4747Da差异蛋白质峰的表达。此外,正常人和不同证型银屑病患者血浆差异蛋白相比较,血热组有3个表达上调的差异蛋白峰(6631Da、9288Da、4965Da);血瘀组有5个表达上调的差异蛋白峰(2863Da、4418Da、6631Da、4965Da、3241Da);血燥组有2个表达上调的差异蛋白峰(4965Da、288Da),1个表达下调的差异蛋白峰(3957Da)。结论:1.本实验首次应用ClinProt技术检测不同证型寻常型银屑病患者与健康人外周血T淋巴细胞膜上及血浆中相关蛋白,发现差异蛋白峰,推测这些蛋白可能与各个证型银屑病的发病机制有关。2.血瘀证银屑病患者与健康人相比,检测出数量较多、差异较大的差异蛋白,推测血瘀证可能参与银屑病发病的关键环节,是辨证的主要病理基础。3.由于本实验只检测到不同证型银屑病患者与正常人差异蛋白的分子量,未鉴定到具体的蛋白,故未能明确同一证型银屑病患者T淋巴细胞膜上的差异蛋白和血浆中的差异蛋白是否为受体和配体的关系。以后还需扩大样本量以期得到更多、更特异的蛋白峰质进行鉴定,继续更深入的研究。
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