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目的:近年来,碳量子点作为一种新型的碳纳米材料受到了人们的广泛关注。因其良好的生物相容性、化学稳定性和优越的荧光性能,碳量子点在生物成像、基因传递、生物传感等领域都有良好广泛的应用。在本课题组先前研究的基础上,本课题以透明质酸和聚乙烯亚胺为前驱物,通过水热碳化法合成了一种新型荧光碳纳米颗粒——HA-PEI CDs(HP-CDs),在保留碳量子点优良理化特性的基础上进一步赋予其新的功能。本课题系统表征了HP-CDs的基本特性,深入研究其在生物成像及基因传递方面的应用潜力,并探索其对肿瘤发展的影响。方法:1.以透明质酸和聚乙烯亚胺为前驱物,通过一步水热碳化法合成HP-CDs。利用高倍透射电子显微镜、X射线衍射仪表征HP-CDs的物理特性;傅里叶变换红外光谱法、X射线光电子能谱表征HP-CDs的化学成分;紫外可见分光光度计、荧光分光光度计表征HP-CDs的光学性能。2.通过CCK-8、溶血实验检测HP-CDs的生物相容性;利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像检测HP-CDs作为荧光探针应用于生物成像的能力。3.通过凝胶阻滞实验观察HP-CDs装载基因的功能;利用琼脂糖凝胶电泳观察HP-CDs对RNA的保护能力;以HP-CDs转染p LV-mi RNA红色荧光质粒通过激光共聚焦显微镜分析HP-CDs的传递基因功能。4.搜索蛋白质数据库后通过q-PCR检测He La和MCF-7 CD44表达差异,确定高、低表达CD44细胞系;q-PCR检测HP-CDs引起上述细胞CD44 m RNA水平的表达变化;流式细胞术分析HP-CDs是否可以通过透明质酸受体—CD44介导的胞吞途径进入肿瘤细胞同时验证HP-CDs的靶向能力;通过Transwell、划痕实验、免疫印迹法探究HP-CDs对肿瘤细胞迁移、侵袭的影响。结果:1.HP-CDs的制备及其理化、光学性能的表征。(1)当透明质酸与聚乙烯亚胺质量比为7:4,180℃加热4小时得到的HP-CDs具有最好的碳化效果和荧光性能;(2)HP-CDs具有均一的分散性,为近似准球形,粒径约2.25nm,呈非晶态的物相结构;(3)HP-CDs主要由碳、氧、氮元素组成,表面富含羟基、羧基、酰胺基等活性基团,水溶性良好;(4)HP-CDs具有优越的荧光性能,光稳定性好。2.HP-CDs生物相容性的表征及其生物成像功能。(1)不同浓度的HP-CDs(50-400μg/m L)对He La、VSMC细胞无明显毒性,能维持细胞活性在90%以上;300μg/m L HP-CDs与上述细胞共培养72小时细胞活性仍保持在90%以上;(2)不同浓度的HP-CDs(50-400μg/m L)均未引起明显的溶血反应;(3)HP-CDs不会引起细胞形态的改变,能被摄入到胞质,在蓝色激发光下发出明亮强烈的绿色荧光。3.HP-CDs介导的基因装载与递送功能。(1)当HP-CDs为目的基因3倍质量时即可完全中和核酸的负电荷。随着HP-CDs量的增加,HP-CDs/DNA复合物向电场负极的迁移幅度逐渐增强,在紫外光照射下即可显示愈发明亮的荧光;(2)HP-CDs可以保护RNA,减轻其被降解程度;(3)HP-CDs作为一种自发绿色荧光的转染试剂,能有效转染目的基因。4.HP-CDs的肿瘤靶向及其对肿瘤迁移、侵袭的影响。(1)基于搜索蛋白质数据库及q-PCR得出He La CD44相对表达量约为MCF-7的122倍的结论,本课题分别选用He La和MCF-7为高、低表达CD44细胞系进行后续实验检测HP-CDs对其作用差异;(2)HP-CDs可以引起上述两种细胞CD44 m RNA水平表达升高,而He La CD44表达升高更明显,间接说明HP-CDs具备结合CD44的能力;(3)He La比MCF-7摄取了更多的HP-CDs,经HA预处理后,两组细胞对HP-CDs的摄取都有不同程度下降,其中He La对HP-CDs的摄取减少更显著,进一步说明HP-CDs与CD44的靶特异性;(4)HP-CDs对肿瘤细胞的迁移、侵袭呈浓度依赖的抑制性,使MMP-2和MMP-9表达下降。结论:1.本课题以透明质酸和聚乙烯亚胺为前驱物,通过水热碳化法成功合成了HP-CDs。HP-CDs分散性、水溶性好,粒径小且均一,含碳、氧、氮元素,有良好的荧光性能;2.HP-CDs具有优越的生物相容性,且自发绿色荧光,可用于生物成像;3.HP-CDs能够传递基因并对目的基因起到保护作用;4.HP-CDs可通过透明质酸受体(CD44)介导的“主动靶向”更多地被高表达CD44的肿瘤细胞摄取,并能抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭行为;