[目 的]（1）通过优化Ficoll密度梯度离心法从人外周血中分离提取PBMC细胞及冻存,并以生物学形态、细胞活力、细胞数量和微生物限度初步进行质量评价,为后期NK细胞的诱导培养提供安全可靠的细胞来源。（2）利用分离检测后的PBMC细胞进行NK细胞的诱导培养,以NK细胞的安全性、有效性、稳定性和便利性为原则,对NK细胞培养全扩增生长周期进行基本细胞生物学属性、微生物学安全性、产品自身安全性、功能性及稳定性研究,最终确定NK细胞作为免疫细胞产品的关键质量指标。[方 法]（1）人外周血PBMC细胞的分离冻存及质量检测:采集人外周血,分离前取样进行血常规和人源特定病毒（如HAV、HCV、HBV）检测,利用Ficoll密度梯度分离液进行分离,对分离后的PBMC细胞进行细胞形态鉴别、细胞数量与活率、NK细胞比例、无菌、支原体和内毒素检测,并对PBMC细胞的冻存研究,为后续NK细胞的诱导培养提供可靠的细胞来源。（2）NK细胞的诱导培养及其培养后NK细胞生物学属性、微生物学安全性、产品自身安全性、功能性及稳定性研究:体外激活和诱导PBMC培养NK细胞,对其全扩增生长周期进行数量、活率、纯度和相关细胞因子的分泌检测,并对培养后的NK细胞进行微生物学安全性检测（无菌、支原体、内毒素检测）和杀伤功能性研究,以及NK制剂的异常毒性反应试验和稳定性试验,综合评价人外周血来源的PBMC诱导培养NK细胞的流程工艺,以及确定其关键质量指标。[结 果]（1）通过Ficoll密度梯度分离液能从人外周血中分离得到足够数量和高活性的PBMC细胞;外周血检测结果表明无特定人源病毒风险;分离后的PBMC细胞包含淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞和其他少量细胞,形态大小不一,经粒径分析PBMC细胞中直径范围在6-15μm之间;经检测细菌、真菌、支原体、内毒素合格。（2）在体外刺激PBMC细胞,向NK细胞方向诱导扩增,从培养结果来看,细胞收获量可到20-40亿,在整个生长扩增保持高活率,均在90%以上,NK细胞比例随着培养时间延长逐渐升高,且在不同个体之间有显著性差异（P＜0.05）。培养后NK细胞生物学形态大多为圆形或椭圆形,大小均一,粒径在10μm左右,对其进行无菌、支原体、内毒素检测均合格,表明整个培养过程无微生物污染风险。NK制剂的异常毒性试验（包括小鼠试验和豚鼠试验）合格,表明NK细胞在整个培养过程无外源性毒性物质引入;在不同效靶比下（1:1、5:1、10:1、20:1、50:1）检测NK细胞对K562细胞的杀伤活性分别为 12.73%±10.42%、21.57%±9.29%、44.88%±14.02%、77.83%±10.03%、87.32%±14.68%,且随着效靶比的提高杀伤作用也不断增强。通过Elisa酶标法检测培养过程NK细胞分泌的穿孔素、颗粒酶-B、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α四种细胞因子,到培养结束时达到峰值。[结 论]本研究通过外周血来源的NK细胞的分离、诱导培养的工艺流程、技术优化,为NK细胞的开发研究、临床研究提供良好的细胞来源。建立NK细胞整个生命周期的质量评价指标,包括细胞特性分析、功能性分析、安全性分析、稳定性研究等方面,以生物学形态、存活率及增殖能力、细胞主要标志物、相关细胞因子分泌、纯度和均一性、无菌试验和支原体检测、内毒素检测、异常免疫反应、生物学效力试验等指标作为质量控制和评价的技术手段,评估了 NK细胞治疗应用的初步安全性与有效性。