一、FADD及其磷酸化的非凋亡功能研究　　 Fas/Fas L信号通路最早被证明在细胞凋亡中起着重要的作用。Fas结合Fas L或Fas抗体后激活细胞凋亡,然后通过其死亡结构域(DD)和FADD的死亡结构域(DD)相互作用,从而招募FADD至细胞膜上。FADD通过其与caspase-8共有的死亡效应结构域(DED)招募caspase-8,造成caspase-8的活化和其后的caspase级联反应,最终导致细胞的死亡。近年来的研究表明,Fas/Fas L信号通路及其下游信号分子,包括FADD,caspase-8和FLIP等,不仅仅参与细胞凋亡,还参与细胞的增殖,参与免疫系统的发育调节。FADD参与细胞增殖的功能与其194位(鼠191位)的丝氨酸的磷酸化相关,人们推测FADD可能以多蛋白复合体的形式行使功能,当然这还有待发现新的FADD结合蛋白来验证这一假说。此外,FADD还跟许多恶性肿瘤的发生发展相关。为了进一步阐明FADD除了细胞凋亡以外的功能,我们通过以下两种方式对FADD进行了更深入的研究。　　 1、利用FADD突变细胞株研究FADD缺失或磷酸化对细胞的影响:　　 已有的关于FADD转基因小鼠和FADD突变体细胞株的研究表明,FADD蛋白191位Ser的磷酸化与细胞周期和免疫系统发育息息相关,是其调控生长和增殖的关键位点。为了进一步深入地研究FADD磷酸化对于细胞周期和免疫系统发育的影响,在本研究中,我们构建了四个FADD突变体细胞株。FADD191位Ser分别突变成Asp(FADD(S191D)),Ala(FADD(S191A)),通过MSCV病毒载体转入FADD-/-MEF细胞,FADD和MSCV空载体作为对照,最终获得四个细胞株:FADD(S191D),FADD(S191A),FADD,MSCV,作为本研究工作的实验材料。这四个细胞株分别代表着细胞中FADD不同的存在形式,其中FADD(S191D)模拟FADD永久磷酸化的状态,FADD(S191A)模拟FADD永久非磷酸化的状态,MSCV代表FADD缺失,FADD则是野生型对照。我们分别用蛋白组学和基因芯片方法分析了四个细胞株中蛋白和基因表达的差异。四个细胞株全蛋白先进行了双向电泳分析,用软件分析筛选出差异高于2倍的蛋白点,这些蛋白点割下后进行MS-MS串联质谱鉴定。结果发现,FADD缺失或突变引起了细胞中很多蛋白质表达的变化。实验中我们一共鉴定了112个蛋白点,这些蛋白分别参与细胞增殖、细胞凋亡、抗原递呈、细胞转运、信号转导、细胞代谢(包括能量代谢、脂肪代谢等)、蛋白降解、细胞骨架折叠等细胞功能,还有一些未知功能的蛋白。这些蛋白的鉴定对研究FADD蛋白的功能及其磷酸化的意义都有着非常重要的作用。同时,我们还对四个细胞株进行了基因芯片分析,软件分析找出了差异在3倍以上的基因。我们发现基因芯片结果跟蛋白组学的结果吻合较好。然后,我们用RT-PCR对这些差异基因进行了验证确认。在这些差异蛋白中,一些与代谢相关的酶(尤其是脂肪酸β氧化途径中的几个关键酶)都发生了显著的变化,这些结果预示着FADD可能与脂肪代谢相关,这较好地解释了FADD(S191D)转基因小鼠的体型瘦小的遗传表型。随后我们在转基因小鼠动物水平上进行了一系列与代谢相关的指标测定,脂肪组织形态学观察,细胞线粒体观察等,发现了FADD(S191D)小鼠脂代谢的异常以及心肌细胞线粒体的空泡化。　　 FADD的突变以及FADD的磷酸化引起细胞一些功能的改变应该是源于FADD蛋白结构的改变。为了更好地研究FADD191位Ser的突变对FADD结构的改变,我们在大肠杆菌BL21中表达了FADD(S191A)、FADD(S191D)、FADD,对纯化得到蛋白进行了各种结构性质的测试,结果表明FADD磷酸化导致FADD蛋白质在结构上发生了较大的变化。这些对于我们研究FADD磷酸化在细胞功能中的作用很有意义。　　 2、利用蛋白组学技术寻找在T淋巴细胞激活过程中与FADD相互作用的蛋白FADD参与免疫系统的发育调节和T细胞的增殖调控,其作用机制很可能是通过多蛋白复合体的形成来行使其生物学功能的。本研究中,我们试图寻找新的FADD结合蛋白。采用内源性免疫共沉淀(IP)和蛋白组学技术相结合的新方法。分别收集小鼠原代T淋巴细胞激活前后的细胞(O,45min,8h,18h),免疫共沉淀FADD复合物后,进行了蛋白质组学分析,一共鉴定了100多个蛋白。其中,有的蛋白在4个时间点都出现,也的只在其中1-2个时间点出现。这说明在T细胞激活的过程中,FADD结合蛋白质、形成蛋白质复合物是一个动态过程,FADD与不同的蛋白质结合发挥不同的生物学功能。我们用贝叶斯算法对这些数据进行了分析归纳。　　 二、HSP家族分子对细胞凋亡的调节及其应用在突然升温和其它应激的条件下,一切生物细胞(包括原核细胞及真核细胞)都合成了一系列蛋白质,这些蛋白质称为热休克蛋白(heat shock protein,HSP),又称为应激蛋白。近年来研究发现,一些HSP家族成员在肿瘤细胞中表达增强。本研究中,我们重点研究了HSP70和HSP27在肿瘤治疗中的作用。　　 首先,我们在肿瘤细胞A549细胞中研究了HSP27和HSP70对细胞凋亡的影响。A549细胞对诱导肿瘤凋亡的肿瘤治疗药物TRAIL不敏感。我们构建了HSP27和HSP70的干扰质粒psiHSP27和psiHSP70,通过PEI转染将A549细胞对HSP27或HSP70蛋白质表达进行干扰后,发现A549细胞对TRAIL的敏感性显著增强,低剂量的TRAIL就可以引起A549细胞发生凋亡,细胞凋亡与转染的干扰质粒量呈一定的剂量依赖关系。为了探究HSP影响细胞凋亡的分子机理,我们用western blot技术检测了HSP干扰后、再行TRAIL处理的A549细胞中两条经典细胞凋亡途径中的关键蛋白,发现HSP的干扰促进了细胞的凋亡。基于信号传导途径的研究结果,我们在肿瘤动物模型上进行了psiHSP70和psiHSP27与TRAIL联合治疗肿瘤的实验研究。采用的动物模型是:背部原位肿瘤生长模型;在此模型中,进行肿瘤原位瘤体内注射HSP干扰质粒和TRAIL腹腔注射联合治疗。研究发现psiHSP70与TRAIL的联合治疗可显著抑制原位肿瘤的生长,而psiHSP27和TRAIL的联合治疗效应不明显。这些结果显示,下调HSP70的功能可以增加肿瘤对药物TRAIL的敏感性,从而达到治疗肿瘤的目的。