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1研究背景氧化应激(oxidative stress)在1985年被作为氧化还原的生物学和医学概念提出,是指机体在受到有害刺激时,机体内高活性分子如活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)自由基产生过多,超出了机体对氧化物清除能力,导致氧化系统和抗氧化系统动态失衡,这种不平衡会引起细胞内脂质、蛋白质和核酸的氧化性损伤,最终导致组织损伤。为维持机体的氧化还原平衡,当自由基过多时,机体会自发产生防御反应以清除氧化产物。机体内源性抗氧化信号通路:Kelch的ECH相关蛋白1(Keap1)-核因子类红细胞2相关因子2(Nrf2)-抗氧化剂响应元素(ARE)途径,可以调节许多抗氧化基因的转录,这些抗氧化基因可保持细胞体内稳态,而解毒基因则可在致癌物和毒素造成损害之前进行处理并消除它们,在机体应对各种外来损伤的防御中起着非常重要的作用,因此被认为是机体内最重要的内源性抗氧化信号通路。正常生理状态下,Keap1通过其DGR结构域和Nrf2的Neh2结构域结合,从而将Keap1-Nrf2异二聚体限制在细胞质内肌动蛋白骨架上,应激刺激导致IVR结构域构象发生改变,从而Nrf2与Keap1解偶联,活化的Nrf2从细胞质转核进入细胞核,与Maf蛋白结合成异质二聚体后与ARE结合,从而促进细胞保护性靶靶基因的表达,包括调控Ⅱ相代谢酶、抗氧化酶或药物转运体的转录活性,从而发挥抗氧化损伤作用。研究显示,抑郁症通常同时伴随着炎症反应与氧化应激的发生,抑郁症患者机体氧化应激的水平升高,抑郁症的焦虑状态,容易导致不同程度各种神经元损伤,然而机体的抗氧化防御能力降低,引起体内蛋白质、脂质以及核酸的氧化损伤,在此病理状态下,氧化应激会通过细胞凋亡、细胞兴奋性毒性、轴突损伤等多种生物学途径最终导致神经变性。同时,氧化应激与肝脏疾病的发生关系密切,有研究表明,通过增强药理途径或基因途径激活Nrf2信号通路可以在不同的氧化应激模型中保护肝脏,Nrf2-ARE信号通路在防治各类肝脏疾病过程中发挥重要作用,比如病毒性肝炎、酒精性和非酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌、胆汁淤积型肝损伤及药物或化学物质引起的肝损伤等。同时,肝脏是ROS攻击的主要器官,当ROS过量时,体内平衡会受到干扰,导致氧化应激,过量的ROS和氧化应激会通过坏死或凋亡机制诱导细胞死亡,严重损害脂质、蛋白质和DNA,从而导致细胞和组织的损伤。这在肝脏疾病以及其他慢性和退行性疾病中起关键作用[1],提示氧化应激与肝脏疾病的发生关系密切。“肝藏血,主疏泄”是机体正常生理功能的前提和基础,气机疏泄正常,推动血液在机体内循行,血液供养全身。肝郁脾虚证肝之疏泄功能受到抑制,气机不畅,滞于形躯或脏腑,从而影响全身气血紊乱累及其他脏腑病变。有研究表明,CUMS诱导的应激抑郁可能损害大鼠肝功能,并造成大鼠肝实质损伤。因此,可以利用6周CUMS造模方法建立的抑郁症肝郁脾虚证小鼠模型,以Nrf2/ARE信号通路为切入点,观察抑郁症肝郁脾虚证肝脏氧化应激水平及损伤程度,探究逍遥散是否可以通过激活Nrf2/ARE信号通路抗氧化应激作用清除自由基修复肝郁脾虚证引起的肝损伤,从而进一步改善肝郁脾虚证证候。2研究方法本研究主要分为三个部分进行:第一部分:采用6周CUMS建立抑郁症肝郁脾虚证病证结合小鼠模型,通过小鼠精神状态、旷场行为、强迫游泳、糖水偏好等方式评价其“肝郁”证候特点,同时通过小鼠体重、摄食量、大便形态变化等观察评价其“脾虚”证候特点。逍遥散是治疗肝郁脾虚证的代表复方,通过逍遥散以方测证评价模型,同时将临床上广泛使用的抗抑郁药氟西汀作为阳性对照药物,比较观察其疗效。第二部分:在成功复制抑郁症肝郁脾虚证小鼠模型的基础上,对小鼠肝组织进行HE染色,观察小鼠肝脏组织病理结构,以及检测小鼠血清中ALT、AST含量和小鼠肝组织中SOD活性和MDA含量,比较各组小鼠差异,观察该模型小鼠是否出现肝功能异常及肝实质损伤,肝脏氧化应激水平的变化。第三部分:以机体重要的内源性抗氧化通路Nrf2/ARE信号通路为观察对象,结合实时荧光定量PCR、免疫印迹法和免疫组织化学法从基因和蛋白水平上,检测小鼠肝脏中该通路相关基因及蛋白的表达情况,结合抑郁症肝郁脾虚证小鼠肝脏功能和实质损伤程度,观察Nrf2/ARE信号通路的变化以及逍遥散的调节作用。以期更全面了解肝郁脾虚证的生物学基础,更深入研究逍遥散作用于肝郁脾虚证的生物学机制,为肝郁脾虚证与肝损伤之间的科学内涵提供实验依据。3研究结果(1)6周CUMS制备抑郁症肝郁脾虚证小鼠模型的评价:造模第6周结束,模型组小鼠的摄食量明显低于正常组小鼠(P<0.01),且逍遥散组小鼠的摄食量明显高于模型组(P<0.01),氟西汀组小鼠摄食量均数稍高于模型组,但无明显差异(P>0.05);模型组小鼠体重明显低于正常组(P<0.01),且逍遥散组与氟西汀组小鼠的体重明显高于模型组(P<0.01);旷场实验表明,模型组小鼠的中央区停留时间比正常组高(P<0.05),模型组小鼠的中央进入次数和旷场箱内总运动距离明显低于正常组(P<0.01),逍遥散组和氟西汀组小鼠在旷场箱内总运动距离明显高于模型组(P<0.01);糖水偏好实验提示,各组小鼠糖水偏好率随着造模时间变化,至造模结束模型组小鼠糖水消耗率明显低于正常组(P<0.01),逍遥散组和氟西汀小组小鼠糖水消耗率明显高于模型组(P<0.01);强迫游泳实验结果显示,与正常组相比,模型组小鼠的强迫游泳时间明显偏高(P<0.01);新环境抑制进食实验发现模型组小鼠进食时间明显高于正常组(P<0.01)。(2)抑郁症肝郁脾虚证小鼠肝脏氧化应激水平变化及损伤情况:观察小鼠肝脏病理结构发现,正常组小鼠肝小叶结构清晰,肝细胞索围绕中央静脉放射状排列,肝细胞大小形态正常,未见变性及坏死,肝窦可见;汇管区少量炎细胞浸润,小胆管如常。模型组小鼠肝小叶结构紊乱,肝细胞肿大,水样变性,肝窦压迫萎缩;汇管区扩张,小胆管轻度增生。反映小鼠肝功能的指标显示,模型组小鼠血清中的ALT、AST含量高于正常组小鼠,差异显著(P<0.01),逍遥散组和氟西汀组小鼠血清中ALT、AST含量高于正常组,与模型组差异明显,具有统计学意义(P<0.01)。检测小鼠肝脏氧化应激水平发现,与正常组相比,模型组、逍遥散组、氟西汀组小鼠肝脏组织的SOD活力降低,MDA含量增高,且模型组均差异显著(P<0.01);与模型组相比,逍遥散和氟西汀药物的干预均提高了小鼠肝脏组织的SOD活力,降低MDA的含量(P<0.01或P<0.05)。(3)抑郁症肝郁脾虚证小鼠肝脏Nrf2/ARE信号通路相关基因的表达情况:采用实时荧光定量PCR技术检测发现,与正常组比较,模型组小鼠肝脏组织Nrf2、HO-1的基因表达均下降(P<0.01),肝脏组织Keap1的基因表达有一定程度的升高(P<0.05)。与模型组比较,逍遥散组、氟西汀组小鼠肝脏组织Nrf2、HO-1的基因表达均升高(P<0.01),Keap1的基因表达量降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)抑郁症肝郁脾虚证小鼠肝脏Nrf2/ARE信号相关蛋白的表达情况:免疫组织化学法所表现出的蛋白水平变化结果与免疫印迹法所测结果基本一致,与正常组相比,模型组小鼠肝脏Nrf2和HO-1蛋白表达明显降低,具有统计学差异(P<0.01),而肝脏Keap1的表达明显升高(P<0.01);经逍遥散干预后,与模型组相比,逍遥散组小鼠肝脏Nrf2和HO-1水平均升高(P<0.05),keap1蛋白表达量降低(P<0.05)。4研究结论(1)6周CUMS可以成功制备抑郁症肝郁脾虚证病证结合小鼠模型。(2)造模可以引起小鼠肝脏氧化应激水平失衡,且肝功能异常,肝组织受损。(3)造模可以引起小鼠肝组织中Nrf2、HO-1蛋白和mRNA的表达下调及Keap1蛋白和mRNA的上调,抑制了该信号通路的转导。(4)逍遥散可通过激活Nrf2/ARE信号通路发挥抗氧化应激作用,减轻肝脏氧化应激以及改善肝损伤。