1873年，德国物理学家Ernst Abbe发现由于光的衍射，传统远场光学显微镜空间分辨率极限大约在250nm(Abbe极限)。上世纪90年代以来，开发了多种用于突破Abbe极限的光学成像新技术和新方法。在这些技术和方法中，单分子定位显微镜(single molecule localization microscopy, SMLM)，比如光活化定位显微镜(photoactivation localization microscopy，PALM)和随机光学重建显微镜(stochasticoptical reconstruction microscopy，STORM)，基于识别和定位单分子荧光闪烁，可获得20-30nm的横向分辨率和60-70nm的轴向分辨率。在SMLM方法中，所探测的为单分子荧光事件，由于单分子荧光信号微弱，及背景和噪声的存在，单分子事件的识别是一件富有挑战的工作。本文提出了一个实时，健壮的单分子荧光识别和定位算法(SNSMIL)，该算法基于光子探测过程中噪声的内在特征(泊松噪声)的分析，即使在高背景和不均匀背景的条件下，也能极大提高单分子荧光事件的识别精度。为了完成实时数据分析，开发了运行在图形处理单元(GPU)上的软件，实现了大规模并行计算，达到数据采集和分析的同步。另一方面，一个典型的SMLM测量需要记录1000-100000帧的图片(成像速度为10-1000帧/秒),每次测量需要几分钟或更长的时间，由于力学弛豫，温度变化等原因，样品漂移(通常1-10nm/s)不可避免，而SMLM成像的目标是几十纳米的超高分辨率图像，样品漂移会降低图像的分辨率，甚至使图像失真，已经成为不可忽略的问题。本文提出了一个亚纳米精度，低成本的抗样本漂移的方法。该方法同时记录荧光图像和明场图像，通过最小化明场图像之间的归一化均方根误差(normalized root-mean-square error，NRMSE)，得到样品的漂移量，该方法不仅可以用于测量完成后的漂移修正，也可以用于测量中的实时漂移补偿。