论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是一种广泛传播且致病性较强的病毒性疾病,其特征是母猪繁殖障碍,不同年龄段猪群表现出呼吸系统症状,对全球养猪业造成严重的经济损失。由于该病毒具有很高的变异性,为了解我国近两年内PRRS的流行状况及变异特点,同时对流行毒株进一步探索。本研究对我国部分地区PRRSV分子流行病学进行分析,完成了流行毒株的毒株分离及GP5蛋白的原核表达,主要内容如下:1.对2015~2016年收集自我国23个省份的发病猪场PRRS疑似病料进行PRRSV病原检测,并对部分具有代表性的阳性病料进行ORF5基因的扩增测序,得到了177个PRRSV ORF5基因序列。结果显示,在3078份疑似病料中,共检测出阳性样本889份,阳性率为28.88%;对得到的ORF5基因序列进行分析,结果显示,177个毒株均属于美洲型毒株,其中90株与我国的HP-PRRSV亚群代表株JXA1高度同源,34株与NADC30高度同源。与2015年相比,2016年我国PRRSV的流行仍以HP-PRRSV为主要流行毒株,NADC30-like毒株在流行毒株中的占比上升了12.04%。同时,PRRSV的流行不具有明显的地域特性。对ORF5基因的推导氨基酸序列进行分析,结果显示部分NADC30-like毒株在N34位糖基化位点存在缺失,提示有必要继续进行PRRSV的分子流行病学监测,为下一步的防控提供依据。2.将PRRSV阳性组织病料进研磨后接种到Marc-145细胞中,连续传代进行病毒分离,在传至第3~4代时出现明显细胞病变。继续传代的同时,对其进行RT-PCR鉴定和测定病毒效价,通过测序验证后确定分离到的3株病毒均为PRRS病毒,分别命名为JX1、JX2、SD1。毒株序列分析后显示3株毒株均属于NADC30-like毒株,对第5代病毒液的病毒效价进行测定,结果显示病毒含量分别为10-6TCID50/0.1m L、10-5.33TCID50/0.1mL、10-5.67TCID50/0.1mL。3.对分离的一株PRRSV流行毒株(JX1)的GP5基因进行扩增,以GP5基因的重组质粒载体为模板分别扩增两条片段,通过融合PCR得到缺失GP5信号肽和跨膜区的基因片段(dORF5),将其克隆到表达载体pGEX-6P-1上。将原核表达载体pGEX-6P-1转化大肠杆菌BL21,用浓度为1 mmol/L的IPTG在37℃条件下诱导。SDS-PAGE电泳检测,所表达蛋白的分子量约为38 kDa,对诱导时间进行优化后发现在5 h时表达量达到最大。对蛋白可溶性进行鉴定显示所表达的部分蛋白具有良好的可溶性。Western Blot结果表明表达出的蛋白与PRRSV阳性血清发生发应,表明所表达的蛋白具有良好的反应原性。