研究背景慢性肾脏疾病(CKD)已经成为全球的重要公共卫生问题之一。慢性肾脏疾病肾功能恶化,病情进展至出现代谢紊乱和临床症状的综合征时称为慢性肾衰竭(CRF)。早在1998年Coresh J等人就指出,慢性肾功能不全患者中高血压是频发的心血管事件。在患有慢性肾脏疾病的个体中,心血管疾病的风险和死亡率显著增加,在传统心血管疾病危险因素中,损伤的肾功能和增加的尿白蛋白可以使发生心血管疾病的风险增加2-4倍,形成恶性循环。因此在慢性肾衰的治疗中,积极控制血压是具有重要意义的治疗措施。中枢神经系统在肾性高血压的形成和发展以及慢性肾脏病的病理生理变化中发挥了重要作用。中枢神经系统中调节神经源性高血压以及对肾脏传入活动能够产生作用的有关核团主要包括:穹窿下器(SFO)、下丘脑室旁核(PVN)、脑干的延髓头端腹外侧核(RVLM)和孤束核(NTS)。脑内SFO和PVN存在局部的RAS,其RAS的活化能够激活交感神经系统,从而使血压升高以及调节外周器官如肾脏的功能。另一方面,在慢性肾衰条件下亦能引起SFO和PVN部位神经元活化、炎症浸润以及交感的活化。不仅如此,在CKD中产生的大量尿毒症毒素亦能通过调节脑内的细胞和分子途径,并且增加中枢神经系统对脑外信号的敏感性来引起神经体液功能的紊乱。原发性高血压患者约50%具有盐敏感性,而CKD患者也同样具有盐敏感性。习惯性饮食盐摄入增加导致了全身血压和肾小球压力的增高,而升高的血压和肾小球压力又增加了蛋白尿、伴随肾功能受损的夜间血压下降等不良肾脏事件的风险,最终发展为终末期肾脏疾病(ESRD)。不仅如此,高盐饮食还可以增加盐敏感性大鼠脑脊液中Na+浓度以及使交感神经系统活性增加,从而使血压升高。有研究证实,高盐摄入引起的CKD的进展可以加重PVN和SFO部位功能的紊乱,表现为炎症浸润、活性氧增加、肾素-血管紧张素系统激活和精氨酸加压素的过度分泌。蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征,它是以蛋白的生物多样性为基础,研究蛋白质的表达水平、蛋白亚型、蛋白质翻译后的修饰、以及蛋白与蛋白之间的相互作用等,由此获得对疾病发生以及细胞代谢等病理生理过程的整体而全面的认识。蛋白磷酸化修饰是在细胞调节和信号转导过程中发挥重要作用的翻译后修饰,它涉及从细胞增殖、分化到细胞凋亡的整个细胞生长过程。蛋白磷酸化在PVN和SFO的功能调节中也发挥了关键作用,其功能涉及能量代谢、RAS活化以及交感活化、突触传递以及神经递质分泌等。因此我们不仅要把注意力放在分析不同病理生理条件下蛋白的表达水平变化,蛋白的磷酸化修饰信号转导同样与疾病的发生发展密切相关。本研究的目的是通过使用相对绝对定量(iTRAQ)技术结合液相色谱-质谱(LC-MS/MS)和TiO 2富集方法来构建高盐负荷下慢性肾衰大鼠脑内PVN和SFO的大规模磷酸化蛋白质组学谱。第二章 盐负荷慢性肾衰大鼠脑内室旁核磷酸化蛋白质组学研究研究方法1、动物模型的构建与组织样本的采集(1)实验动物购买及饲养;(2)大鼠5/6肾切除(5/6Nx)建立慢性肾衰模型;(3)眼眶静脉采血及鼠尾法测血压;(4)大鼠随机分组,并用不同浓度盐饮食刺激3周;(5)大鼠血、新鲜脑组织的留取及处理;(6)血肌酐检测。2、运用 iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantification)技术对 PVN部位进行磷酸化蛋白质组学分析(1)蛋白提取;(2)SDS-PAGE电泳;(3)酶解和肽段定量;(4)肽段标记;(5)二氧化钛富集;(6)质谱分析;(7)数据分析;(8)Western Bloting验证所选磷酸化蛋白的改变。结果1、慢性肾衰大鼠模型的成立经5/6Nx的大鼠,血肌酐及血压均较假手术组显著升高(p<0.05)。2、给予不同盐饮食后大鼠血压,血肌酐的改变正常盐饮食的大鼠中,5/6Nx组血压及血肌酐明显高于sham组(p<0.05),而在5/6Nx大鼠中,高盐饮食组血压明显高于正常盐饮食组(p<0.05)。3、给予不同浓度盐饮食后大鼠PVN部位磷酸化肽段的改变(1)磷酸化肽段的定量结果共鉴定到了 3723种磷酸化肽段对应1530个磷酸化蛋白,其中有定量信息的肽段为3719种。在NC/NS(5/6Nx+正常盐饮食 vs sham+正常盐饮食)比较组中274种磷酸化肽段(133种上调,141种下调)发生了差异表达。而在HC/NC(5/6Nx+正常盐饮食 vs 5/6Nx+高盐饮食)比较组中,高盐导致了 302种(160种上调,142种下调)磷酸化肽段发生了差异性改变。(2)所鉴定到肽段磷酸化位点分布共鉴定出4548个有较高可信度的磷酸化位点,其中丝氨酸,苏氨酸,络氨酸发生磷酸化的个数分别为4019,513,16。(3)总的磷酸化蛋白的基因本体(GO)分类脑内PVN部位的磷酸化蛋白参与的主要生物学过程包括细胞过程、单有机体过程、生物调节等。(4)差异磷酸化蛋白的基因本体(GO)分类无论NC/NS组亦或是HC/NC组,差异磷酸化蛋白参与最多的生物学过程都主要包括细胞过程、单有机体过程、生物调节等,而其分子功能则主要有结合、转运活性、催化活性等。(5)差异磷酸化蛋白相互作用分析在NC/NS组的211种磷酸化蛋白中,有25种差异蛋白能直接或间接地形成功能上的联系,其中连接最多的磷酸化蛋白有Mapla、Hsp90aa1、Dpys13、Syn1、Atp1a1、Atp1a2和Carmk2a。而HC/NC组的224种差异磷酸化蛋白中有24种差异蛋白能直接或间接地形成功能上的联系,其中连接最多的磷酸化蛋白有 Mapk3、Map1a,Camk2a、Syn1、Dnm1 和 Map2。(6)差异磷酸化蛋白KEGG信号通路注释分析结果显示NC/NS组中差异蛋白主要参与涉及的信号通路有cAMP信号通路、紧密连接、内吞、胰岛素分泌、Ras信号通路、Mapk信号通路、PI3K-Akt信号通路等,其功能涉及细胞增殖、细胞通讯和凋亡、能量代谢、神经递质分泌、神经信号传导等。HC/NC组中,差异磷酸化蛋白主要参与cAMP信号通路、钙信号通路、胰岛素分泌、Mapk信号通路、PI3K-Akt信号通路、醛固酮合成和分泌等,其功能涉及细胞增殖、细胞通讯和凋亡、能量代谢、神经递质分泌、神经信号传导等。(7)盐负荷下慢性肾衰大鼠PVN部位phospho-dynamin1和phospho-TPPP的蛋白改变免疫印迹结果显示,在5/6Nx大鼠中,与正常盐饮食组相比,高盐饮食组phospho-dynamin1和phospho-TPPP的表达水平均明显升高(p<0.05),这与蛋白质谱鉴定结果是一致的。结论1、本实验利用iTRAQ技术成功地构建了盐负荷慢性肾衰大鼠PVN部位的磷酸化蛋白质组学谱,共鉴定出了 3723种磷酸化肽段,对应1530种磷酸化蛋白,其中有定量信息的肽段有3719种。2、NC/NS比较组,慢性肾衰导致了 133种磷酸化肽段上调和141种磷酸化肽段下调。而HC/NC 比较组,高盐饮食诱导了 160种磷酸化肽段上调和142种磷酸化肽段下调。3、所鉴定到的差异磷酸化蛋白的生物学功能主要有结合、催化和转运蛋白活性及其他一些重要功能。第三章 盐负荷慢性肾衰大鼠脑内穹窿下器磷酸化蛋白质组学研究研究方法同上。结果1、确认慢性肾衰大鼠模型的的成功构建经5/6Nx的大鼠,血肌酐及血压均较假手术组显著升高(p<0.05),而各组大鼠体重则无明显差异。2、给予不同盐饮食后大鼠血压,血肌酐的改变正常盐饮食时5/6Nx大鼠血压及血肌酐明显高于sham组(p<0.05),而在5/6Nx大鼠中,高盐饮食组血压明显高于正常盐饮食组(p<0.05)。3、给予不同浓度盐饮食后大鼠SFO部位磷酸化肽段的改变(1)磷酸化肽段的定量结果共鉴定到了 6808种磷酸化肽段对应2661个磷酸化蛋白,其中有定量信息的肽段有6719种。在NC/NS组中418种磷酸化肽段(168种上升,250种下调)发生了差异表达,而HC/NC组中,高盐饮食导致了 278种(154种上调,124种下调)磷酸化肽段的差异性改变。(2)所鉴定到肽段磷酸化位点分布共鉴定出11992个有较高可信度的磷酸化位点,其中丝氨酸,苏氨酸,络氨酸发生磷酸化的个数分别为10474,1417,101。(3)差异磷酸化蛋白的基因本体(GO)分类结果显示,NC/NS组和HC/NC组中差异磷酸化蛋白参与的主要生物学过程包括细胞过程、单有机体过程、生物调节、生物过程调节、应激反应等。分子功能分析显示,NC/NS组和HC/NC组差异蛋白参与的分子功能主要有结合、催化活性、分子功能调节、转运活性、结构分子活性等。(4)差异磷酸化蛋白相互作用分析在NC/NS组中,有51种差异蛋白能直接或间接地形成功能上的联系,其中连接最多的磷酸化蛋白有Dlgap1、Syp、Syn1、Map1a、Stx1a等。而HC/NC组的差异磷酸化蛋白中有22种能直接或间接地形成功能上的联系,其中连接最多的磷酸化蛋白有 Dlg4、Dlg2、Map1a、Map2、Syngap1 等。(5)差异磷酸化蛋白KEGG信号通路注释分析结果显示差异磷酸化蛋白主要参与的信号通路有cAMP信号通路、Mapk信号通路、肿瘤通路、Wnt信号通路等。其功能涉及细胞增殖、细胞通讯和凋亡、能量代谢、神经递质分泌、神经信号传导等。还发现了与血压调节相关的Wnt/β-catenin信号通路和与RAS相关的p38/Hsp27信号通路中β-catenin和Hsp27磷酸化水平的改变。结论1、本实验利用iTRAQ技术成功地构建了盐负荷下慢性肾衰大鼠SFO部位的磷酸化蛋白质组学谱,共鉴定出了 6808种磷酸化肽段,对应2661种磷酸化蛋白,其中有定量信息的肽段为6719种。2、NC/NS 比较组,慢性肾衰导致了 168种磷酸化肽段上调和250种磷酸化肽段下调。而HC/NC 比较组,高盐饮食诱导了154种磷酸化肽段上调和124种磷酸化肽段下调。3、所鉴定到的差异磷酸化蛋白的生物学功能主要有结合、催化活性、分子功能调节和转运蛋白活性及其他一些重要功能。