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背景与目的原发性家族性脑钙化症（Primary familial brain calcification,PFBC）是一类以颅内对称性钙化为特征的神经系统遗传性疾病。临床上主要表现为运动障碍、小脑性共济失调、精神症状、认知障碍、癫痫等。大部分PFBC呈常染色体显性遗传,少数呈常染色体隐性遗传。目前,该病已克隆5个致病基因,包括SLC20A2,PDGFRB,PDGFB,ISG15和XPR1。PFBC发病机制可能与大脑局部磷转运功能障碍、血脑屏障功能异常及IFN-α/β免疫信号过度放大有关。XPR1作为2015年发现的PFBC最新致病基因,其确切的致病机制尚未明确。本研究通过对PFBC患者进行XPR1基因突变检测,对于发现的变异位点进行功能分析,以明确XPR1基因导致PFBC的分子机制。此外,目前该病缺乏有效的治疗方法,根本原因在于发病机制不明,对PFBC发病机制的研究目前尚缺乏较合适的动物模型。SLC20A2是PFBC最常见的致病基因,但Slc20a2基因全敲除对小鼠有严重的全身并发症,极大限制了该病表型的模拟和致病机制的探讨。据此,本研究基于Cas9-EGFPfl/fl小鼠模型,构建纹状体Slc20a2基因敲除小鼠模型,以期能为PFBC发病机制研究提供一种理想的在体模型。方法1.对已排除SLC20A2,PDGFRB,PDGFB基因突变的PFBC患者,应用PCR扩增结合Sanger测序对其进行XPR1基因的突变筛查,对于发现的变异位点进行家系共分离、正常对照筛查、生物学软件功能预测、多物种同源比对等分析,判定变异位点致病性。同时,查阅文献总结携带XPR1基因突变的PFBC患者的临床表现特征。2.对发现的突变位点,应用Real-Time PCR,Western Blot,免疫荧光等技术分析突变型与野生型在RNA、蛋白表达量及定位上的差异;同时,采用酶标法分析细胞磷转运功能差异,运用Fluo-3AM检测细胞[Ca2+]i浓度变化;3.采用Real-Time PCR及Western Blot分析XPR1基因组织表达谱及颅脑各部分XPR1蛋白的表达规律;通过免疫共沉淀分析XPR1蛋白与已知致病蛋白（SLC20A2,PDGFRB,PDGFB）的相互作用;4.通过CRISPR-Cas9技术,体外筛选出针对SLC20A2基因的靶点sgRNA,将sgRNA重组至AAV-CRE病毒上,采用立体定位方法,将病毒介导至Cas9-EGFPfl/fl鼠纹状体构建组织特异性模型,分别从DNA、蛋白、脑片组化及影像学等方面鉴定SLC20A2基因敲除效果以及相应的病理表征。结果1.对13个PFBC家系,122例散发患者进行XPR1基因突变分析,分别在两个家系中发现了2个新发突变c.490G>T（p.D164Y）及c.1708C>T（p.R570C）。XPR1基因突变在PFBC患者中发生频率为1.5%（2/135）。通过分析基因型与表型关系,发现携带XPR1基因突变的PFBC患者钙化面积较大,常累及小脑,临床症状以运动障碍为主,其中构音障碍,面部肌张力障碍最为多见;2.新发突变并未引起RNA表达水平的改变。在蛋白水平,c.490G>T（p.D164Y）突变导致XPR1蛋白表达降低,其半衰期明显提前,抑制蛋白酶体途径会上调该变异蛋白表达;c.1708C>T（p.R570C）突变对蛋白表达影响不明显,但蛋白的稳定性降低。突变并未影响蛋白的定位,但降低细胞对磷排出的功能以及增加钙池操纵性钙内流功能而上调细胞内钙浓度。3.XPR1基因mRNA在小鼠脑部、肺部及肾脏高度表达,在心脏、肝脏表达较少,肌肉表达最少。XPR1蛋白在小脑、纹状体高度表达。XPR1蛋白与PDGFRB存在相互作用,同时XPR1蛋白和PDGFRB蛋白在细胞膜上共定位。4.在体外证实靶向SLC20A2的sgRNA体外具有引导Cas9蛋白发挥切割活性,包装后的AAV-SLC20A2-sgRNA-CRE具有CRE重组酶活性。通过立体定向注射AAV-SLC20A2-sgRNA-CRE发现AAV病毒能够在纹状体表达CRE重组酶激发GFP表达,提取纹状体组织DNA,经测序发现SLC20A2基因被成功编辑,免疫印迹显示PiT2蛋白表达下降,有待于通过影像进一步监测颅内钙化灶形成。结论1.XPR1基因在中国PFBC患者中较为少见。携带XPR1基因突变的PFBC患者钙化面积较大,常以运动障碍为主要临床表现。2.发现的两个XPR1突变位点c.490G>T（p.D164Y）,c.1708C>T（p.R570C）可导致细胞磷排出功能降低,钙池操纵性钙内流功能增强,提示其具有致病性。3.表达谱分析XPR1蛋白在小脑、纹状体高度表达,这正是PFBC患者钙化灶的好发部位。4.PFBC致病基因PDGFRB可能是XPR1基因的上游,其基因突变导致了该信号通路的异常,最终导致磷转运功能失调而致病。5.基于CRISPR-Cas9技术,可实现小鼠纹状体Slc20a2基因的特异敲除,有望建立组织特异性小鼠模型。