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微生物与人类生活息息相关,它们在不同生活场景中均扮演着十分重要角色。在解决人类疾病问题时,可以应用微生物的方面有:揭示疾病病理;微生物代谢物和代谢化合物库筛选与利用;基于蛋白结构信息的计算机辅助药物设计;药物的微生物合成;用于菌群治疗的微生物制剂等。利用微生物筛选特异性药物或参与药物合成途径,成为解决人类神经系统疾病的重要且可行方案之一。已有研究表明,属于SLC1A家族的hEAAT2具有谷氨酸转运和介导阴离子电导双重功能,负责摄取突触间隙中90%Glu以避免其产生的兴奋性毒性。当蛋白功能失调或障碍时可导致多种神经系统疾病,而目前还没有以此蛋白为治疗靶标药品上市,这引起我们的研究兴趣。因此,本文以微生物药物筛选靶点蛋白hEAAT2为研究对象,对其结构和转运机制进行深入研究,为后续药物筛选提供数据支撑。在本文研究中,我们对重组表达hEAAT2蛋白性质和生理功能进行验证,包括有蛋白多聚体性质验证、重组nanodisc条件探索、以及全细胞膜片钳技术验证hEAAT2蛋白功能活性。实验结果有,Glu介导阴离子电流,其Km值为30±2.5μM;抑制剂WAY-213613阻碍蛋白阴离子泄漏电流,其Ki值为0.07±0.03μM。在去污剂条件下制备冷冻样品,并利用单颗粒冷冻电镜技术,解析得到分辨率均为3.4?的hEAAT2与Glu和抑制剂WAY-213613结合复合物结构。两个结构均为内向开口状态,分别记作hEAAT2Glu和hEAAT2W。结构的密度图中观察到一些脂分子密度,根据其形状将其分配为CHS和DDM,以及其他暂用PC分配。我们推测生理条件下,膜环境中类似CHS的胆固醇可能参与蛋白多聚体组装或与蛋白活性相关;存在于hEAAT2W中靠近抑制剂结合位点的DDM分子,则可能被生理相关脂质分子替代,并通过WAY-213613参与到Glu转运的抑制作用。hEAAT2Glu结构中,Glu与其周围广泛而保守残基参形成极性相互作用,其中包含有两个带电荷残基D475TM8和R478TM8。在该结构中,蛋白的HP2结构部分不直接参与底物结合,但其上特异性残基S441HP2与S444HP2可与HP1、TM7及TM8上残基间形成氢键相互作用,使HP2关闭更严,进一步地稳定Glu结合。为验证结构中参与或协助Glu结合残基重要性,我们设计突变体(D475ATM8、R478ATM8和S441GHP2)电生理实验。实验结果表明残基D475TM8和R478TM8突变,导致突变体即使在1 m M Glu条件下也不具有激活阴离子电流能力。而此时,抑制剂WAY-213613还能发挥阻碍突变体阴离子泄漏电流作用,因此突变体不能产生Glu激活电流原因是突变体丧失了Glu结合能力,即有这两个保守性残基与Glu结合相关。此时,WAY-213613对突变体D475ATM8和R478ATM8的Ki值分别增大至30.48μM和1.68μM,这暗示这两个位点还可能参与WAY-213613结合。有趣的是,S441GHP2突变体显示出对Glu极高亲和力（Km值为0.39μM）,是野生型hEAAT2的77倍。我们推测,尽管S441HP2不直接参与Glu结合且该残基仅特异性存在于hEAAT2中,但其参与形成的氢键作用有助于Glu结合时HP2稳定在密封构象,阻止Glu在细胞质侧释放。当S441HP2被突变后,这些相互作用也被破坏,从而促进Glu的释放,加速Glu转运循环,致使hEAAT2偏向具有更高通道开放概率。此时,WAY-213613对S441GHP2突变体Ki值增大至0.26μM,暗示该位点可能还会以某种方式影响抑制剂结合。hEAAT2W复合物结构中,抑制剂WAY-213613的天冬酰胺基团占据Glu结合时相似位点,其中有残基D475TM8直接与WAY-213613形成氢键相互作用。WAY-213613的溴氟苯酚和苯胺基团与空腔周围残基形成阳离子-π键和疏水相互作用,残基R478TM8参与形成阳离子-π键。这些观察到的结构信息,正好与WAY-213613对突变体D475ATM8和R478ATM8亲和力降低的电生理结果相互印证。hEAAT2W与hEAAT2Glu结构的叠合比较,揭示了WAY-213613竞争性结合hEAAT2的结构变化过程。即有WAY-213613从胞内侧接近蛋白时,抑制剂与HP2间的疏水作用导致HP2尖端发生向外侧转动22°,产生远离HP1的显著构象变化,随后抑制剂通过形成疏水相互作用和氢键与蛋白紧密结合,反过来使HP2关闭受阻,结构趋于稳定。结构中hEAAT2特异性残基S441HP2与T395TM7形成新的氢键,也具有稳定WAY-213613结合的作用,这与S441GHP2突变体对WAY-213613敏感性降低结果一致。为探究抑制剂WAY-213613对hEAAT2特异性高于其他EAATs亚型的结构基础,我们将hEAAT2W与h EAAT3Na（PDB ID:6X2L）结构进行比较。发现这两个蛋白在WAY-213613的溴氟苯酚基团位置周围有三个残基发生替换,即hEAAT2中TM8上的I464-L467-V468残基簇在h EAAT3中被替换为Val-Leu-Ile。在h EAAT3结构中可以看到抑制剂结合空腔缩减,因此我们推测这种残基簇的差异性是抑制剂WAY-213613能与hEAAT2蛋白形成高亲和力结合的结构基础。电生理结果有,突变体I464VTM8、L467ITM8和V468ITM8不改变Glu激活阴离子电流的Km值,却减少突变体蛋白对抑制剂WAY-213613选择性（Ki值分别为0.17μM,0.46μM和0.2μΜ）,这支持我们依据结构信息做出的推断。最后,通过将hEAAT2W与多个内向开口同源蛋白结合抑制剂的复合物结构进行比较,分析抑制剂所在位置差异性,我们揭示出一个新的抑制剂结合模式。本研究首次解析了hEAAT2的结合天然底物谷氨酸和抑制剂WAY-213613复合物结构,可作为开发研制hEAAT2疾病相关药物时的分子动力学模拟数据来源。首次分析了hEAAT2蛋白中特异性残基S441HP2在蛋白中的重要功能,对该残基作用的更进一步的研究,将有助于发掘一类与蛋白通道活性相关残基,增加人们对EAATs通道活性相关疾病研究。本研究中首次证实,hEAAT2蛋白中的I464-L467-V468残基簇负责抑制剂高选择性识别,并揭示出新的抑制剂结合模式。这些创新发现将为理性设计靶向hEAAT2蛋白特异性药物研发提供更多选择和解决思路。从而为后续进行的hEAAT2相关微生物天然代谢产物或候选化合物筛选,以及使用微生物或微生物来源酶制剂参与到药物合成途径,提供直接的结构信息。最终实现通过微生物的方法获得治疗hEAAT2相关神经系统疾病药物的目的。