淀粉分支酶(1,4-α-glucan branching enzyme,简称GBE;EC 2.4.1.18)是一种直接参与淀粉生物合成的糖基转移酶,它能够切断淀粉分子中的α-1,4-糖苷键,并将切下的链段以α-1,6-糖苷键的形式连接至受体链上形成新的分支。关于不同来源的GBE在大肠杆菌(Escherichia coli)中的胞内表达的研究已有很多报导,如果实现其分泌表达,将大大提高应用潜力。此外,目前GBE酶活普遍较低,限制了其工业发展。同时,对GBE结构与功能的研究尚未深入,确定其活性中心将对采用分子手段提高酶活具有十分重要的意义。本论文以来源于Geobacillus thermoglucosidans STB02的GBE为研究对象,首先实现了GBE在大肠杆菌中的分泌表达,并进行机理分析。其次研究了GBE的作用机制,为生产改性淀粉提供理论指导。然后以310位氨基酸为突变对象,探究此位点对催化活性、底物特异性、转苷模式的影响规律。最后,以活性中心处的349位氨基酸为突变对象,构建具有更高酶活的突变体,并分析其可能的机理。主要研究结果如下:(1)实现了GBE在大肠杆菌BL21(DE3)中的分泌表达,在不同发酵条件下进行重复验证,先后考察了初始培养基、发酵温度、发酵时间、初始pH、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度等因素对GBE分泌表达的影响。结果表明,在不同发酵条件下都能在发酵上清液中测得GBE酶活。尤其是在培养基为TB、发酵温度为30°C、初始pH为7.5、IPTG浓度为0.005 mM的条件下培养48 h最有利于GBE的胞外生产。这是国内外首次关于GBE在大肠杆菌中的分泌表达的报道。(2)探究了GBE不依赖信号肽在大肠杆菌中进行分泌表达的机理。首先,大肠杆菌分泌表达GBE与菌体生长具有明显的同步效应。对GBE进行定位发现细胞各组分中都存在GBE,说明了GBE的胞外运输需要两步跨膜。通过扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)观察细胞形态结构,排除了由细胞自溶而造成GBE渗漏的可能。其次,通过N-端测序以及构建含有pe1B信号肽质粒发现重组菌分泌GBE的过程与含原载体pET-20b(+)/gbe的重组菌明显不同。说明构建载体pET-20b(+)/gbe时已经去除了pe1B信号肽。接着,分别构建不同载体的重组质粒发现含有不同重组质粒的菌株分泌GBE的过程十分接近,证明GBE的分泌表达不是由载体造成的。利用定点突变构建的保守氨基酸残基突变体(D352N、E452Q、D420N)胞外上清液中均存在GBE且分泌量与野生型相当,但却检测不到酶活,说明了GBE的分泌表达和酶的活性形式无关。最后,N-端截断的突变体(Nd1-10)胞外酶活、目的蛋白分泌量都受到了明显的抑制,推测GBE的分泌表达与N-端氨基酸密切相关。(3)探究了GBE与淀粉的作用方式,在最适反应条件下测定其底物特异性,发现GBE更倾向作用于支链淀粉。以直链淀粉为底物,测定GBE的水解作用和转苷作用,反应初期两者同时进行,但以转苷作用为主导。使用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测器(HPAEC-PAD)分析GBE的转苷模式,推测其最小作用链段为聚合度(DP)20,倾向于转移链段DP 7~17。通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)测定产物相对分子质量,发现有环状聚合物的生成,说明GBE可以进行环化反应。(4)验证了GBE的活性中心。通过氨基酸序列比对得到GBE催化位点为Asp309、Glu452,同时发现310位丙氨酸在原核生物来源GBE亚族中非常保守。通过定点突变对关键氨基酸310位丙氨酸进行功能研究。将310位丙氨酸分别替换为甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺后,比酶活均不足野生型的10%~25%。HPAEC-PAD分析显示突变体没有改变GBE的转苷模式,但使其转苷能力受到限制。动力学分析表明310氨基酸残基影响着GBE的底物特异性。以上结果表明310位丙氨酸与GBE的催化活性、底物特异性密切相关。(5)在确定了GBE的活性中心之后,通过氨基酸序列分析发现349位蛋氨酸在相似性较高的细菌型来源GBE中较保守。通过定点突变在349位上引入羟基类氨基酸残基,相比于野生型GBE,突变体M349T和M349S的比酶活分别增加了24.5%、21.1%。通过GBE改性淀粉应用研究,发现马铃薯淀粉经过突变体M349T、M349S改性后,α-1,6-分支度分别提高了25.5%、16.5%。机理分析结果表明,将蛋氨酸替换成苏氨酸和丝氨酸提高了GBE的比酶活,可能是因为349位氨基酸残基可以与周围氨基酸残基形成了额外的氢键,同时对活性位点环境的疏水性影响较小。