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第一部分TRIM52对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和细胞周期的影响目的:通过研究TRIM52在肝癌组织和细胞中的表达水平,TRIM52对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和细胞周期的影响,TRIM52对体内肿瘤的生长效应,探讨TRIM52在肝癌中的生物学作用。方法:(1)采用免疫组织化学法检测肝癌组织和相邻非肿瘤肝脏组织中TRIM52的表达情况。(2)分别采用qRT-PCR和Western blot检测肝癌细胞(包括MHCC-97H和MHCC-97L细胞)与人正常肝细胞L02中TRIM52的表达水平。(3)将shRNA TRIM52和scramble shRNA克隆至pLKO.1慢病毒载体中以构建pLKO.1-shRNA-TRIM52 和 pLKO.1-scramble shRNA 慢病毒表达载体,并分别转染MHCC-97H细胞。将TRIM52的编码序列克隆至pLVX-Puro慢病毒载体中以构建pLVX-Puro-TRIM52慢病毒表达载体,利用空pLVX-Puro慢病毒载体作为阴性对照,并分别转染MHCC-97L细胞。(4)采用CCK-8法检测TRIM52对肝癌细胞增殖的影响。(5)采用流式细胞仪和Transwell实验检测TRIM52对肝癌细胞细胞周期、迁移和侵袭的影响。(6)将分别转染了 pLKO.l-shRNA-TRIM52 和 pLKO.l-scramble shRNA(NC)的MHCC-97H细胞接种于裸鼠体内以建立异种移植瘤模型。待成瘤后每3天用游标卡尺测量肿瘤大小。接种后33天将裸鼠处死,取出裸鼠体内肿瘤测量大小并称重。采用HE染色和免疫组织化学法检查肿瘤。结果:(1)与相邻非肿瘤肝脏组织相比,TRIM52在肝癌组织中的表达明显增加。(2)与人正常肝细胞L02相比,TRIM52在MHCC-97H和MHCC-97L细胞中的表达水平明显升高。(3)与 pLKO.1-scramble shRNA 转染组(NC)相比,shRNA-TRIM52 明显抑制MHCC-97H 细胞的增殖。与 pLVX-Puro转染组(Vector)相比,pLVX-Puro-TRIM52明显促进MHCC-97L细胞的增殖。(4)与 pLKO.1-scramble shRNA 转染组(NC)相比,shRNA-TRIM52 明显增加G0-G1期MHCC-97H细胞的比例,降低S期和G2-M期MHCC-97H细胞的比例。与pLVX-Puro 转染组(Vector)相比,pLVX-Puro-TRIM52 明显增加 S 期 MHCC-97L 细胞的比例,降低G0-G1期和G2-M期MHCC-97L细胞的比例。(5)与 pLKO.1-scramble shRNA 转染组(NC)相比,shRNA-TRIM52 明显抑制MHCC-97H细胞的迁移和侵袭。与pLVX-Puro转染组(Vector)相比,pLVX-Puro-TRIM52明显促进MHCC-97L细胞的迁移和侵袭。(6)与 pLKO.l-scramble shRNA 转染组(NC)相比,pLKO.1-shRNA-TRIM52 转染组裸鼠体内的肿瘤明显缩小,重量明显减轻,生长速度明显减慢,肿瘤Ki67的表达明显减少。结论:TRIM52上调促进肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和细胞周期进程。第二部分PPM1A对TRIM52介导的肝癌细胞增殖、迁移和侵袭增强的影响目的:通过研究 TRIM52 对肝癌细胞中 p21、MMP2、PPM1A、p-Smad2/3 和 Smad2/3表达的影响,TRIM52与PPM1A在肝癌细胞中的相互作用,PPM1A对TRIM52介导的肝癌细胞增殖、迁移和侵袭增强的影响,探讨TRIM52调控肝癌发生和进展的分子机制。方法:(1)将构建的 pLKO.1-shRNA-TRIM52 和 pLKO.1-scramble shRNA慢病毒表达载体分别转染MHCC-97H细胞。(2)采用 Western blot 检测 MHCC-97H 细胞中 p21、MMP2、PPM1A、p-Smad2/3和Smad2/3的表达水平。(3)将构建的pLVX-Puro-TRIM52慢病毒表达载体和空pLVX-Puro慢病毒载体分别转染MHCC-97L细胞。(4)采用 Western blot 检测 MHCC-97L 细胞中 p21、MMP2、PPM1A、p-Smad2/3和Smad2/3的表达水平。(5)采用免疫共沉淀明确PPM1A与TRIM52在肝癌细胞中的相互作用。(6)将PPM1A的编码序列克隆至pLVX-Puro慢病毒载体中以构建pLVX-Puro-PPMlA慢病毒表达载体,利用空pLVX-Puro慢病毒载体作为阴性对照,并分别转染MHCC-97L细胞。(7)采用CCK-8法检测PPM1A上调对MHCC-97L细胞增殖的影响。(8)采用Transwell实验检测PPM1A上调对MHCC-97L细胞迁移和侵袭的影响。(9)采用 Western blot 检测 MHCC-97L 细胞中 p21、MMP2、PPM1A、p-Smad2/3和Smad2/3的表达水平。结果:(1)与 pLKO.l-scramble shRNA 转染组(NC)相比,shRNA-TRIM52 明显提高MHCC-97H细胞中p21和PPM1A的表达水平,降低MMP2的表达水平,诱导Smad2/3的去磷酸化。(2)与 pLVX-Puro 转染组(Vector)相比,pLVX-Puro-TRIM52 明显降低 MHCC-97L细胞中p21和PPM1A的表达水平,提高MMP2的表达水平,诱导Smad2/3的磷酸化。(3)TRIM52 与 PPM1A 在 MHCC-97H 和 MHCC-97L 细胞中相互作用。shRNA-TRIM52明显抑制MHCC-97H细胞中PPM1A的泛素化。(4)与 pLVX-Puro 转染组(Vector)和 pLVX-Puro-TRIM52 转染组相比,pLVX-Puro-PPMlA明显抑制MHCC-97L细胞的增殖、迁移和侵袭。与pLVX-Puro-TRIM52 转染组相比,pLVX-Puro-PPMlA 和 pLVX-Puro-TRIM52(共转染)明显抑制MHCC-97L细胞的增殖、迁移和侵袭。(5)与 pLVX-Puro 转染组(Vector)和 pLVX-Puro-TRIM52 转染组相比,pLVX-Puro-PPMlA明显提高MHCC-97L细胞中p21和PPM1A的表达水平,降低MMP2的表达水平,诱导Smad2/3的去磷酸化。与pLVX-Puro-TRIM52转染组相比,pLVX-Puro-PPMlA 和 pLVX-Puro-TRIM52(共转染)明显提高 MHCC-97L 细胞中 p21和PPM1A的表达水平,降低MMP2的表达水平,诱导Smad2/3的去磷酸化。结论:PPM1A上调抑制TRIM52介导的肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的增强,TRIM52上调通过PPM1A泛素化促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。第三部分TRIM52促进乙型肝炎病毒相关肝癌细胞增殖的实验研究目的:通过研究TRIM52和HBx在乙型肝炎病毒相关肝癌组织中的表达,HBx对TRIM52和NF-κB p65表达的影响,TRIM52对HepG2.2.15细胞增殖的影响,NF-κB阻断剂对TRIM52表达和HepG2.2.15细胞增殖的影响,探讨TRIM52在乙型肝炎病毒相关肝癌中的生物学作用。方法:(1)采用荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒相关肝癌患者外周血HBV DNA载量。(2)分别采用qRT-PCR和Western blot检测乙型肝炎病毒相关肝癌组织、乙肝后肝硬化组织和相邻正常肝脏组织中TRIM52的表达水平。(3)采用Western blot检测乙型肝炎病毒相关肝癌组织、乙肝后肝硬化组织和相邻正常肝脏组织中HBx的表达水平。(4)构建HBx过表达载体(HBx-pcDNA3.1),将其转染HepG2细胞以建立HBx过表达细胞模型。(5)分别采用qRT-PCR和Western blot检测HBx-pcDNA3.1转染的HepG2细胞中TRIM52的表达水平。(6)分别采用 qRT-PCR 和 Western blot 检测 L02、HepG2 及 HepG2.2.15 细胞中TRIM52与NF-κB p65的表达水平。(7)将pLKO.1-shRNA-TRIM52慢病毒表达载体转染HepG2.2.15细胞,分别采用qRT-PCR 和 Western blot 检测 HepG2.2.15 细胞中 TRIM52 的表达水平。采用 CCK-8法检测TRIM52下调对HepG2.2.15细胞增殖的影响。(8)将不同浓度的PDTC(NF-κB抑制剂)加入HepG2.2.15细胞中,采用Western blot检测HepG2.2.15细胞中TRIM52的表达水平。采用CCK-8法检测PDTC对HepG2.2.15细胞增殖的影响。结果:(1)所有乙型肝炎病毒相关肝癌患者外周血HBVDNA载量均大于103 IU/mL。(2)TRIM52在乙型肝炎病毒相关肝癌组织中的表达水平最高,而在相邻正常肝脏组织中的表达水平最低。(3)HBx在乙型肝炎病毒相关肝癌组织中的表达水平最高,而在相邻正常肝脏组织中的表达水平最低。(4)TRIM52在HBx-pcDNA3.1转染组中的表达水平较未转染组和阴性对照组(NC)均明显升高。(5)在HepG2和HepG2.2.15细胞中TRIM52与NF-κB p65的表达水平均明显升高,而这种升高在HepG2.2.15细胞中更明显。(6)与未转染组和阴性对照组(NC)相比,TRIM52-shRNA明显降低HepG2.2.15细胞中TRIM52的表达水平。(7)与未转染组和阴性对照组(NC)相比,pLKO.1-shRNA-TRIM52转染后24h、48h和72h,HepG2.2.15细胞的增殖能力明显下降,而且这种抗增殖作用具有时间依赖性。(8)加入PDTC后,HepG2.2.15细胞中TRIM52的表达水平明显降低。(9)在分别添加不同浓度的PDTC 24h、48h和72h后,HepG2.2.15细胞的增殖受到明显抑制,而且PDTC对HepG2.2.15细胞增殖的抑制作用具有剂量依赖性。结论:TRIM52促进乙型肝炎病毒相关肝癌细胞增殖,HBx通过NF-κB信号通路调控TRIM52的表达。