440nm蓝光联合核黄素角膜交联治疗细菌性角膜炎的实验研究

来源 :山东大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:squllwu20090907
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细菌性角膜炎是由细菌感染导致的角膜炎症,可引起角膜上皮缺损和基质坏死,是一种严重危害视力的眼部疾病。其中尤以金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌感染最常见、最严重。其治疗目前主要依靠局部滴用抗生素滴眼液,但是因受到多种外界因素以及滥用抗生素的影响,部分细菌发生变异而产生一定的耐药性,导致治疗效果不佳,Chang VS回顾分析了 20年里葡萄球菌感染的角膜炎,发现耐药率达30.7%。对于迁延不愈的角膜溃疡,有人尝试结膜瓣或羊膜覆盖,但这会降低滴眼液的渗透性,必须在感染控制后才能做此手术。感染严重致角膜溶解时,只能行角膜移植手术治疗,但是角膜材料有限,且术后常会出现排斥反应或炎症复发,以至于相当一部分患者最终不得不进行眼球摘除术来根治。角膜交联术(CXL)是通过合适的光源照射激发核黄素产生活性氧族,诱导角膜胶原纤维的氨基之间发生光化学交联反应,从而增加了胶原纤维的机械强度和抵抗角膜扩张的能力,已广泛应用于角膜扩张病变,疗效肯定。2000年,Scnitzler E首次报道了 CXL用于治疗角膜溃疡有效,之后大量的临床报道证实CXL是一种新的、有效的治疗感染性角膜炎的方法。相对于大多数抗生素只能从杀灭病原体一方面治疗角膜炎,CXL可以从消除病原体、增加角膜的抗酶活性以及减轻相关炎症反应三方面来治疗角膜溃疡,给角膜溃疡的治疗带来了新的曙光。波长270nm左右的紫外光B、370nm左右的紫外光A、445nm左右的蓝光同为核黄素的吸收峰,均可以激发核黄素产生交联反应。光线的穿透能力与其波长呈正比,波长越长,穿透力越强,370nm紫外光A仅能穿透300um的角膜,440nm蓝光介导的交联深度应该较370nm紫外光更深,而细菌性角膜炎时角膜均会水肿变厚,溃疡深度往往会超过300um,据此,我们设想440nm蓝光介导的交联治疗严重角膜溃疡的效果应该优于370nm紫外光A。1998年,Spoer1 E等人报道了465nm蓝光联合核黄素诱导的CXL可以起到加固离体猪角膜的作用,2008年Iseli报道蓝光CXL可以增加巩膜胶原纤维的机械强度。但440nm蓝光联合核黄素诱导角膜交联治疗角膜溃疡尚未见报道。本文第一部分应用440nm蓝光联合核黄素对金黄色葡萄球菌感染的兔角膜溃疡进行了交联治疗,旨在观察验证其对细菌性角膜溃疡的治疗效果,并与370nm紫外光A进行比较,观察其疗效是否优于后者。第二部分初步观察了 440nm蓝光核黄素交联治疗金葡菌角膜溃疡,是否对角膜内皮、视网膜、脉络膜等眼部组织有损害。第一部分 440nm蓝光核黄素角膜交联治疗细菌性角膜炎的疗效研究目的:通过动物实验观察440nm蓝光核黄素角膜交联治疗金黄色葡萄球菌角膜溃疡的疗效,与空白对照组对比,观察其治疗是否有效;与370nm紫外光A联合核黄素角膜交联治疗组对比,观察其治疗效果是否优于后者。方法:1.实验设计:选取60只健康新西兰大白兔,右眼为实验眼,全麻后中央角膜浅基质层内注入0.1ml浓度为5×107cfu/ml金黄色葡萄球菌菌液,制作金黄色葡萄球菌感染的较严重的角膜溃疡模型,将造模成功的54只纳入研究,随机分为三组,每组18只。其中18眼行440nmm波长蓝光核黄素角膜交联,18眼行370nm紫外光A核黄素角膜交联,另外18眼作为空白对照组,仅在另外两组行交联治疗的同时,给予一次刮除溃疡表面疏松坏死组织治疗。于交联后第1天、3天、7天、14天分别观察比较各组疗效。2.角膜交联方法:10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉,角膜测厚,确保最薄点大于400um。去除角膜中央直径9mm疏松溃疡组织及残存上皮,1g·L-1核黄素溶液滴角膜每4-5min 1次,共30min。440nm蓝光和370nm紫外光A照射能量均为3mw· cm-2,照射直径均为9mm,工作距离50mm,照射角膜时间均为30分钟。3.观察指标:交联后1天、3天、7天、14天,观察眼部分泌物、结膜充血、前房积脓及角膜浸润情况,给予炎症评分并行统计学分析;分别给予角膜照相并利用Image J软件对溃疡面积进行比较分析;同时蘸取所有实验眼溃疡表面坏死组织或分泌物进行细菌培养。交联后1天、7天、14天共焦显微镜观察炎症细胞变化,各组分别摘取两实验眼角膜,制作切片,HE染色,光学显微镜下观察其病理组织学改变。结果:1.三组实验眼眼部炎症评分比较:CXL治疗前,三组实验眼眼部炎症评分无统计学差异(P =0.814,P>0.05)。CXL治疗后第1天、3天、7天、14天,三组眼部炎症评分的差异均有统计学意义(P =0.000、0.000、0.000、0.000,P<0.05),440组与对照组比较,差异均有统计学意义(P=0.001、0.000、0.000、0.000,P<0.05),370组与对照组比较,差异均有统计学意义(P=0.000、0.000、0.000、0.000,P<0.05),440组和370组比较均无统计学差异(P = 0.557、0.567、0.488、0.537,P>0.05)。至观察结束,对照组所有实验眼均角膜穿孔。2.每组眼部炎症评分变化:440组五个时间点评分有统计学差异(P= 0.000,P<0.05),呈下降趋势。370组四个时间点评分有统计学差异(P= 0.002,P<0.05),也呈下降趋势。对照组四个时间点眼部炎症评分有统计学差异(P=0.000,P<0.05),呈上升趋势。3.三组实验眼角膜溃疡面积比较:角膜交联治疗前及治疗后第1天、第3天,三组角膜溃疡面积均无统计学差异(P>0.05,P =0.881、0.845、0.066);治疗后第7天、第14天,对照组角膜溃疡面积显著大于440组和370组(P<0.05,q=5.895、5.571),而440组和370组角膜溃疡面积无统计学差异(P>0.05,q=0.323、0.582)。4.三组实验眼细菌培养结果:CXL前三组兔眼细菌培养均为阳性。CXL后第1天、3天、7天、14天,440组和370组细菌培养均转为阴性,而对照组均为阳性。5.三组实验眼病理结果:CXL后第1天,病理切片三组均可见角膜上皮缺失,大量炎性细胞聚集达深基质;第7天,对照组形成角膜全层脓肿,但后弹力膜尚完整,370组和440组可见角膜上皮多层愈合,溃疡组织内见新生血管、大量炎细胞及少量纤维母细胞增生;第14天,对照组溃疡加重,形成全角膜脓肿,后弹力膜仅部分可见,几近穿孔,370组和440组角膜上皮多层愈合,基质内新生血管、瘢痕组织及纤维母细胞增生,炎性细胞较前减少。6.三组实验眼共焦显微镜结果:CXL后第1天,三组实验眼溃疡处基质层内均见大量炎性细胞,CXL后第7天,440组和370组实验眼基质层内仍见大量炎性细胞,但少于对照组实验眼。CXL后第14天,440组和370组实验眼基质层内炎性细胞较前减少,对照组仍见大量炎性细胞。结论:1.440nm蓝光核黄素角膜交联能有效控制金黄色葡萄球菌感染的角膜溃疡。2.440nm蓝光核黄素角膜交联治疗细菌性角膜溃疡疗效与370nm紫外光A比较无显著差异。3.440nm蓝光核黄素角膜交联治疗细菌性角膜溃疡的安全性、远期疗效有待进一步研究。4.440nm蓝光核黄素角膜交联有望成为难治性角膜溃疡的治疗方法。第二部分440nm蓝光联合核黄素角膜交联治疗兔细菌性角膜炎的安全性研究目的:观察440nm蓝光核黄素角膜交联治疗兔细菌性角膜炎,对角膜内皮、视网膜、脉络膜、巩膜及视神经的影响,初步探讨其治疗细菌性角膜炎的毒副作用。方法:选取8只健康新西兰大白兔,浅基质法制作金黄色葡萄球菌角膜溃疡模型,每眼注射菌液0.08ml,余步骤同第一部分。24小时后造模成功,全麻下进行440nm蓝光核黄素角膜交联,步骤同第一部分。于交联治疗后第1天、第7天分别气栓处死4只兔子,摘取实验眼眼球,其中各两只放入4%多聚甲醛溶液中固定做病理切片,另四只眼球分别立即取下整个角膜,用锥兰一茜素红联合染色法对角膜内皮进行染色观察。结果:角膜交联后第1天,角膜内皮染色未见异常,视网膜、脉络膜、巩膜及视神经病理组织切片未见异常。角膜交联后第7天,角膜内皮染色未见异常,视网膜、脉络膜、巩膜及视神经病理组织切片未见异常。结论:440nm蓝光联合核黄素角膜交联治疗细菌性角膜溃疡安全性较好,未发现对角膜内皮、视网膜、脉络膜、巩膜、视神经造成组织学危害。
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