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磷脂酶A2是一种在自然界中广泛存在的酶类，具有抗肿瘤、抗菌、抗凝血、抗血栓等多种生物学活性，使其在药物开发上具有巨大潜力。 本实验室从长白山白眉蝮蛇蛇毒中纯化出一种毒素，序列测定结果表明，该毒素为一种磷脂酶A2同源物，49位为Gln，命名为Gln49-磷脂酶A2(Gln49-phospholipase A2，简称Gln49-PLA2)。对Gln49-PLA2的活性进行检测，结果表明其具有多种生物学活性，如神经毒性、肌肉毒性和类丝氨酸蛋白酶活性等，然而磷脂酶水解活性并未被检测到。序列比对及进化树分析结果表明，Gln49-PLA2和蛇毒Asp49-PLA2(93％-61％)的亲缘性要高于Lys49-PLA2(60％-56％)。生物信息学分析和三级结构模拟表明，Gln49可能是影响Gln49-PLA2磷脂酶催化活性的关键因素，因其与江浙蝮蛇Asp49-PLA2相比，在催化反应发生时，干扰了Ca2+的固定。为了确认49位氨基酸残基在磷脂酶催化活性上所起的作用，实验室将Gln49-PLA2的49位氨基酸残基定点突变为Asp，并在大肠杆菌中进行重组表达，结果多为包涵体，不利于蛋白质结构与功能的研究。本论文的研究目的是探究Gln49-PLA2及突变体基因的可溶表达。 本研究利用昆虫细胞杆状病毒表达体系对Gln49-PLA2及其突变体基因Asp49-PLA2进行重组表达，在供体质粒pFastBacTM Dual的PH启动子下游，插入目的基因片段;在另一启动子P10下游插入增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)报告基因。将构建正确的重组供体质粒转化含病毒基因组的大肠杆菌DH10Bac宿主细胞，提取重组病毒杆粒，脂质体介导转染昆虫细胞Sf9，收获培养上清即为重组病毒储液，将其感染Sf9细胞，外源表达Gln49-PLA2及其突变体蛋白，SDS-PAGE分析检测到细胞破碎上清液中存在一条14 kDa左右的蛋白条带(Gln49-PLA2，Asp49-PLA2)。采用Hitrap SP阳离子交换层析对重组蛋白进行分离纯化，质谱鉴定结果表明Gln49-PLA2及突变体Asp49-PLA2在昆虫细胞中成功表达。纯化后Gln49-PLA2蛋白具有与天然酶相同的降解纤维蛋白原的活性，不具有磷脂酶活性，而49位氨基酸残基改变的Asp49-PLA2蛋白获得了磷脂酶水解活性，比酶活为3.33 U/μg，但不具有降解纤维蛋白原活性。证实了49位氨基酸残基Gln是导致Gln49-PLA2磷脂酶活性缺失的主要原因，对其降解纤维蛋白原活性也具有重要影响作用。然而由于杆状病毒表达系统表达重组蛋白耗时长、步骤繁琐，并且在纯化过程中可能存在蛋白酶降解，尝试构建重组克隆质粒pET21b(+)-Asp49-PLA2，利用大肠杆菌无细胞蛋白合成体系进行体外表达，SDS-PAGE检测到培养上清液中存在14 kDa左右的目的条带，分离纯化得到的重组 Asp49-PLA2具有磷脂酶活性，初步表明Asp49-PLA2在大肠杆菌无细胞蛋白合成体系中表达成功。